免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的抗體

免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體,。單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體,，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后,，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清,，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物。

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免疫組化常用的染色方法

根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法,，免疫酶標(biāo)法,，親和組織化學(xué)法，后者是以一種物質(zhì)對(duì)某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測(cè)方法,。這種方法敏感性更高,，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位,，其中生物素—抗生物素染色法常用。 南京有靠譜的能做免疫組化的公司嗎,？?jī)?nèi)蒙古免疫組化注意事項(xiàng)

英瀚斯生物為您整理免疫組化實(shí)驗(yàn)步驟

1,、石蠟切片置于65℃烘箱中烘片2h，脫蠟至水,，用PBS沖洗三次,，每次5min。

2,、切片置于EDTA緩沖液中微波修復(fù),，中火至沸后斷電，間隔10min低火至沸,。

3,、自然冷卻后PBS洗3次，每次5min,。4,、切片放入3%過(guò)氧化氫溶液，室溫下孵育10min,，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,。

5、PBS洗3次,，每次5min,，甩干后5%BSA封閉20min（封閉電荷）。

6,、去除BSA液,，每張切片加入50μl稀釋的一抗覆蓋組織，4℃過(guò)夜,。

7,、PBS洗3次，每次5min,。

8,、去除PBS液，每張切片加50μl-100μl相應(yīng)種屬的二抗,，4℃孵育50min,。

9、PBS洗3次,，每次5min,。

10、去除PBS液，每張切片加50-100μl新鮮配制DAB溶液,，顯微鏡控制顯色,。

11、顯色完全后,，蒸餾水或自來(lái)水沖洗,，蘇木素復(fù)染，1%鹽酸酒精分化（1s）,，自來(lái)水沖洗,，氨水返藍(lán)，流水沖洗,。

12,、切片經(jīng)過(guò)梯度酒精（70-100%）10min一個(gè)梯度，脫水干燥,，二甲苯透明,，中性樹(shù)膠封固。 湖南大鼠免疫組化外包在南京英瀚斯做的免疫組化,，效果不錯(cuò),！

免疫組化染色呈陰性結(jié)果的原因有哪些,？

1,、抗體濃度和質(zhì)量問(wèn)題以及抗體來(lái)源選擇錯(cuò)誤。不是抗體濃度越高就越易出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果,，抗原抗體反應(yīng)有前帶和后帶效應(yīng),，必須摸索比較好濃度。

2,、抗原修復(fù)不全,，對(duì)于甲醛固定的組織必須用充分抗原修復(fù)來(lái)打開(kāi)抗原表位，以利于與抗體結(jié)合,；建議微波修復(fù)用高火4次*6min試試,。有人做過(guò)實(shí)驗(yàn)，這是比較好的時(shí)間和次數(shù),。若不行,，還可高壓修復(fù)。

3,、組織切片本身這種抗原含量低,。

4、血清封閉時(shí)間過(guò)長(zhǎng),。

5,、DAB孵育時(shí)間過(guò)短。

6、細(xì)胞通透不全,，抗體未能充分進(jìn)入胞內(nèi)參與反應(yīng),。

7、開(kāi)始做免疫組化,，建議一定要首先做個(gè)陽(yáng)性對(duì)照片,，排除抗體等問(wèn)題。

免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本是什么樣的,？

實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類,，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片,、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片,。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本**常用、**基本的方法,，對(duì)于組織形態(tài)保存好,，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對(duì)照觀察,；還能長(zhǎng)期存檔,，供回顧性研究；石蠟切片制作過(guò)程對(duì)組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響,，但可進(jìn)行抗原修復(fù),，是免疫組化中優(yōu)先的組織標(biāo)本制作方法。

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免疫組化結(jié)果要如何分析,？

 （1）陽(yáng)性著色細(xì)胞計(jì)數(shù)法。在40*光鏡下,，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野,，機(jī)器或人工計(jì)數(shù)陽(yáng)性著色細(xì)胞，每組3~6張不同動(dòng)物組織切片,，然后進(jìn)行組間比較即可,。

（2）灰密度分析法?？梢酝ㄟ^(guò)在不同組別和不同動(dòng)物組織切片上選擇相同區(qū)域,、相同條件下用image j進(jìn)行灰密度分析，然后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析即可,。

（3）評(píng)分法,。用光學(xué)顯微鏡下對(duì)組織切片分別按染色程度（0~3分為陰性著色,、淡黃色、淺褐色,、深褐色）,、陽(yáng)性范圍進(jìn)行評(píng)分（1~4分為0~25%、26~50%,、51~75%,、76~100%），**終可以分?jǐn)?shù)相加,，再進(jìn)行比較,。對(duì)于以上這幾種方法，各有利弊,，請(qǐng)細(xì)心選擇,。要想得到正確結(jié)果的前提是你要做出著色均勻、背景很淺的高質(zhì)量切片,。

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免疫組化分類中免疫酶標(biāo)方法,，英瀚斯生物為您介紹,。免疫酶標(biāo)方法是繼免疫熒光后，于60年代發(fā)展起來(lái)的技術(shù),。基本原理是先以酶標(biāo)記的抗體與組織或細(xì)胞作用,，然后加入酶的底物,，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，通過(guò)光鏡或電鏡,，對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)的各種抗原成分進(jìn)行定位研究,。免疫酶標(biāo)技術(shù)是目前定位準(zhǔn)確、對(duì)比度好,、染色標(biāo)本可長(zhǎng)期保存,，適合于光、電鏡研究等,。免疫酶標(biāo)方法的發(fā)展非常迅速,，已經(jīng)衍生出了多種標(biāo)記方法，目前在病理診斷中廣為使用的當(dāng)屬***法（過(guò)氧化物酶-抗過(guò)氧化物酶）、ABC法（卵白素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物）,、SP法（鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶）,、即用型二步法（聚合物鏈接）等。內(nèi)蒙古免疫組化注意事項(xiàng)