為什么超速離心提取外泌體看不到沉淀,？答：這種問題通常有三種可能性,，其一：使用的細(xì)胞上清或者血清量太低,，從而造成了這樣的結(jié)果。其二：使用了不透明的超速離心管,，一般來說外泌體產(chǎn)量都比較小,，所以凡是不透明的管子，基本都是比較難見到明顯沉淀的,，可以當(dāng)做有沉淀,，然后操作下去即可。其三：使用了角轉(zhuǎn),。部分品牌離心機(jī)的角轉(zhuǎn)管壁粘附性比較低,，超離結(jié)束沒多久沉淀就會滑落下去，所以請在離心結(jié)束時趕緊去收樣,。外泌體的角色：1,、外泌體發(fā)揮功能并一定需要受體細(xì)胞攝入外泌體：外泌體的膜蛋白有可能與細(xì)胞膜蛋白作用，活躍細(xì)胞內(nèi)通路,。2,、外泌體的角色之一：細(xì)胞-細(xì)胞通訊,，比如抗原遞呈,。外泌體作為蛋白質(zhì)的藥物遞送載體。外泌體攝取

磁珠免疫法分離外泌體：將針對目的抗原的抗體通過生物素-鏈霉親和素連接到磁珠表面,，然后將磁珠與樣品共孵育,，使外泌體特異性結(jié)合到磁珠上形成磁珠-外泌體復(fù)合物，再用蒸餾水或者PBS沖洗,，結(jié)尾用甘氨酸-Tris-HCl溶液洗脫獲得外泌體,。該方法相對于ELISA的好處主要是，珠粒提供了更大的表面積來捕獲外泌體,，從而提高了分離效率,。此外，使用磁珠時，樣品起始體積沒有上限,，而基于微孔板的ELISA分析的較大樣品體積為100μL,，且ELISA洗脫雜質(zhì)時容易造成孔間交叉污染。當(dāng)將磁珠法與金標(biāo)準(zhǔn)外泌體分離方法進(jìn)行比較時,，磁珠法可分離出更純凈的外泌體,，特異性高、速度更快,，并且不需要昂貴的儀器,。另外，與其他分離方法（如超速離心或超濾）相比,，磁珠法不影響外泌體形態(tài),。但是采用磁珠法時，外泌體生物活性易受PH和鹽濃度影響,。血清外泌體label free外泌體能夠穿過血腦屏障以將特定藥物輸送到中樞的神經(jīng)系統(tǒng)是外泌體遞送藥物的一個明顯優(yōu)勢,。

常規(guī)生物學(xué)實驗中，實時定量PCR技術(shù)（RT-PCR）普遍用于microRNA的檢測實踐中,，但外泌體樣品中的microRNA豐度極低,，普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿足。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù),，成為外泌體microRNA檢測的選擇技術(shù),。微滴式數(shù)字PCR（DropletdigitalPCR），又成為“油包水PCR”,，在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理,，即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子,，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子,。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個對每個微滴進(jìn)行檢測,，有熒光信號的微滴判讀為1,，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度,。

酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）：將其中一種針對外泌體表面抗原的抗體固定在微孔板的表面上,，將外泌體樣品暴露于含有固定抗體的孔中，由于抗體-抗原相互作用,，表達(dá)抗原的外泌體將被捕獲固定在板上,。將未捕獲的樣品內(nèi)容物洗掉，并使用另一種抗體檢測固定的外泌體,。ELISA已用于從尿液,、血漿和血清中分離出外泌體，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)液（已知外泌體的量）創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線時，甚至可以進(jìn)行定量,。但是,，此方法需要通過超速離心或超濾對樣品進(jìn)行預(yù)處理。同樣,，流場-流分離與紫外線分析儀和光散射檢測器相結(jié)合已被用于分析外泌體的大小和純度,。外泌體屬于胞外囊泡類，除了外泌體之外細(xì)胞還分泌微泡以及其它的膜囊泡,。人體內(nèi)多種細(xì)胞及體液均可分泌外泌體,，包括內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞,、血小板,、平滑肌細(xì)胞等。

外泌體的提取主要包括以下幾種方式：1,、免疫磁珠法,，這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高,、操作簡單,、不需要昂貴的儀器設(shè)備，但是非中性pH和非生理性鹽濃度會影響外泌體生物活性,，不便進(jìn)行下一步的實驗,。2、PS親和法,，該方法將PS（磷脂酰絲氨酸）與磁珠結(jié)合,，利用親和原理捕獲外泌體囊泡外的PS。該方法與免疫磁珠法相似,，獲得的外泌體形態(tài)完整,，純度較高。由于不使用變性劑,，不影響外泌體的生物活性,，外泌體可用于細(xì)胞共培養(yǎng)和體內(nèi)注射。3,、色譜法,，這種方法分離到的外泌體在電鏡下大小均一,，但是需要特殊的設(shè)備,，應(yīng)用不普遍。流式細(xì)胞技術(shù)是細(xì)胞和小顆粒定性和定量表征的有效方法,，其用于外泌體定量檢測的準(zhǔn)確性也在不斷上升,。浙江外泌體tmt

從研究上來講并不太嚴(yán)格區(qū)分外泌體或微泡。外泌體攝取

細(xì)胞攝取診療性外泌體：從樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中分離出的診療性外泌體可對靶細(xì)胞產(chǎn)生特定的作用,，包括新抗原呈遞,、免疫調(diào)節(jié)和藥物有效載荷傳遞。診療性外泌體對靶細(xì)胞的影響可能是通過不同的進(jìn)入或相互作用機(jī)制來控制的,。完整的外泌體的進(jìn)入可能包括受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用,、網(wǎng)格蛋白包被小凹、脂筏,、吞噬作用,、小凹和大胞飲作用。外泌體的內(nèi)容物的進(jìn)入或外泌體信號的誘導(dǎo)可能涉及配體受體誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信號或融合,，從而將外泌體內(nèi)容物沉積到細(xì)胞質(zhì)中,。外泌體攝取

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