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來源: 發(fā)布時間:2023-03-07

密度梯度離心法根據(jù)在蔗糖,、碘海醇或碘克沙醇等惰性溶液中的浮力密度將外泌體分成特定的層,目前普遍應(yīng)用的是蔗糖,,這種方法可以成功地將亞細胞成分(例如過氧化物酶體,線粒體和核內(nèi)體)分離到密度梯度溶液中的不同層中。樣品被放置在梯度的頂部,,當施加離心力時,,樣品中的顆粒以獨特的速率通過梯度,該梯度以從上到下的密度增加,。樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集,,隨后可以通過分餾收集,密度梯度超速離心對從蛋白質(zhì)聚集體和非膜顆粒中分離出外泌體非常有效,。此方法獲得的外泌體純度較高,,但步驟繁瑣、費時且會造成外泌體損失,。需要開發(fā)大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)量可控的外泌體并快速純化外泌體的技術(shù)和策略,。腦脊液外泌體lncRNA芯片

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NTA技術(shù)已被作為外泌體表征手段之一,相較于其他表征方式NTA技術(shù)的樣本處理更簡單,、更能保證外泌體原始狀態(tài),、檢測速度更快。大致方法是:將分離的外泌體樣本注入納米顆粒追蹤分析儀,,用激光光束穿過樣本,,激光在腔室內(nèi)與顆粒相互作用時會發(fā)生散射,通過裝有攝像頭的顯微鏡收集散射光,,捕捉外泌體的布朗運動,,實現(xiàn)顆粒可視化,。然后使用Stokes-Einstein方程來測量粒子的平均速度,,繼而估算粒子的大小。NTA能夠測量粒徑10-1000nm之間的顆粒,,包含了外泌體50-150nm的徑粒范圍,,但是NTA鑒定需要大于0.5毫升的樣品體積以及優(yōu)化的數(shù)據(jù)收集和分析參數(shù),另外,,NTA比較難區(qū)分與外泌體具有相似布朗運動的蛋白質(zhì)聚集體,,因此無法排除其他物質(zhì)干擾。江西海洋生物外泌體外泌體的納米球膜型結(jié)構(gòu)由雙層脂質(zhì)形成,。

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外泌體的臨床應(yīng)用:間充質(zhì)干細胞是目前較普遍使用的細胞類型,,它具有自我更新,多向分化,、分泌細胞因子和細胞外囊泡體,、免疫調(diào)節(jié)、來源普遍等特點,,在流感病毒的臨床診療中取得了良好的成果,。間充質(zhì)干細胞來源外泌體與間充質(zhì)干細胞有著相似的功能,,包括修復(fù)與再生組織、阻止炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)機體免疫,,但外泌體相對于間充質(zhì)干細胞又有許多優(yōu)勢,。首先,間充質(zhì)干細胞來源外泌體更穩(wěn)定,,更好保存,,易于管理和控制,可以人為改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量,。其次,,它們沒有活細胞,不會像間充質(zhì)干細胞那樣可能會過多增殖而放大療效或者病變導(dǎo)致疾病加重,;另外,,它有可能避免某些針對間充質(zhì)干細胞的調(diào)控問題,間充質(zhì)干細胞來源外泌體有代替間充質(zhì)干細胞的趨勢,。

外泌體生物學(xué)功能:1,、在心血管系統(tǒng)中,據(jù)報道,,源自人胚胎干細胞(ESC)的間充質(zhì)干細胞(MSC)外泌體可減少小鼠和豬模型中的心肌缺血和再灌注損傷,;2、在免疫系統(tǒng)中,,據(jù)報道趨化因子受體CCR5通過外泌體在細胞之間轉(zhuǎn)移是細胞人類免疫缺陷病毒傳染的一種機制,;3、在中樞的神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中,,外泌體的作用是消除廢物并介導(dǎo)大腦活動,,從而阻止神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機理;迄今為止,,尚未完全發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)外泌體-細胞結(jié)合的途徑,。然而,比較明顯,,其結(jié)合過程從外泌體識別受體細胞PM上的特定受體開始,。膜受體的識別是外泌體細胞反應(yīng)的基礎(chǔ),它可能活躍受體并隨后導(dǎo)致相關(guān)信號通路的活躍,,外泌體與PM融合或外泌體的內(nèi)吞作用,,從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)和RNA直接釋放到受體細胞中。外泌體可以將PD-L1轉(zhuǎn)運至其他PD-L1表達低或沒有PD-L1的細胞,,并可能與PD-1結(jié)合,。

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外泌體作為細胞間信使較早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細胞上清液中,是直徑為30~150nm,,密度為1.10~1.18g/ml的細胞外囊泡,,攜帶豐富的遺傳信息,,參與細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細胞遷移,、瘤子新生血管生長和瘤子微環(huán)境形成等過程。由于現(xiàn)存的分離技術(shù)是基于外泌體的大小,、結(jié)構(gòu)和膜蛋白的親和捕獲,,比較難完全將其與其他囊泡和大分子蛋白質(zhì)復(fù)合體區(qū)分開,分離出的外泌體蛋白濃度通常會被高估,,并且不同亞型外泌體之間可能會有不同蛋白質(zhì)特征,,所以對分離的外泌體進行鑒定對于后期研究至關(guān)重要。外泌體具有異質(zhì)性,,即使是同一種細胞分泌的外泌體都有可能具有比較大功能區(qū)別,。干細胞提取試劑盒成分

隨著外泌體研究的不斷深入,它的應(yīng)用已經(jīng)涉及醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)和免疫領(lǐng)域,、寄生蟲領(lǐng)域,。腦脊液外泌體lncRNA芯片

常規(guī)生物學(xué)實驗中,實時定量PCR技術(shù)(RT-PCR)普遍用于microRNA的檢測實踐中,,但外泌體樣品中的microRNA豐度極低,,普通RT-PCR技術(shù)的靈敏度已經(jīng)不能夠滿足。第三代微滴式數(shù)字PCR——ddPCR技術(shù),,成為外泌體microRNA檢測的選擇技術(shù),。微滴式數(shù)字PCR(DropletdigitalPCR),又成為“油包水PCR”,,在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理,,即將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴,其中每個微滴或不含待檢核酸靶分子,,或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子,。經(jīng)PCR擴增后,逐個對每個微滴進行檢測,,有熒光信號的微滴判讀為1,,沒有熒光信號的微滴判讀為0,根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度,。腦脊液外泌體lncRNA芯片

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