外泌體的提取分離的方法：1,、超速離心法（差速離心）：超離法是較常用的外泌體純化手段,，采用低速離心,、高速離心交替進(jìn)行,，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡(jiǎn)單,，獲得的囊泡數(shù)量較多而廣受歡迎,，但過程比較費(fèi)時(shí),，且回收率不穩(wěn)定（可能與轉(zhuǎn)子類型有關(guān)）,，純度也受到質(zhì)疑；此外,，重復(fù)離心操作還有可能對(duì)囊泡造成損害,，從而降低其質(zhì)量。2,、密度梯度離心：在超速離心力作用下,，使蔗糖溶液形成從低到高連續(xù)分布的密度階層，是一種區(qū)帶分離法,。通過密度梯度離心,，樣品中的外泌體將在1.13-1.19g/ml的密度范圍富集。此法獲得的外泌體純度較高,，但步驟繁瑣,，耗時(shí),。外泌體中含有核酸，包括miRNA,、DNA,、lncRNA、mRNA,。羊水提取試劑盒廠家

外泌體分離的主要挑戰(zhàn)之一是消除納米級(jí)污染物,，包括干擾外泌體標(biāo)志物解析的游離核酸和脂蛋白。超速離心是目前分離外泌體的主要技術(shù),。盡管如此,，它仍難以符合臨床應(yīng)用所需的標(biāo)準(zhǔn)，主要是由于該方法得到的外泌體純度不足,，產(chǎn)量較低,，完整性欠佳且分離純化操作耗時(shí)長(zhǎng)。其他方法,，例如基于聚乙二醇（PEG）的沉淀,，磷脂酰絲氨酸親和捕獲，尺寸排阻色譜法和膜親和捕獲,，近年來已經(jīng)出現(xiàn)在特定的應(yīng)用中,，但是只適用于特定場(chǎng)景。近來,，非對(duì)稱流場(chǎng)-流分離方法已被用于從細(xì)胞和瘤子培養(yǎng)基中高分辨率地分選EV亞群,，但其通量受到繁瑣的樣品制備程序的影響。單一分析耗時(shí)的過程也限制了其普遍的應(yīng)用,。因此,，目前亟需開發(fā)創(chuàng)新技術(shù)以提高外泌體分離純化的效率，純度,，產(chǎn)量,，速度和耐用性?；诔瑸V的技術(shù)提供了潛在的有前途的替代方法,，但它們也有缺點(diǎn)。在切向流過濾中,，使進(jìn)料流平行于多孔膜流動(dòng),，以避免堵塞。然而,，盡管已實(shí)現(xiàn)使用切向流過濾從大量條件細(xì)胞培養(yǎng)基中濃縮外泌體,，但受制于其一次性模塊的成本高，高剪切應(yīng)力,，難以處理小體積樣品等因素而難以應(yīng)用于臨床分析,。體液外泌體提取試劑盒價(jià)格提取的外泌體的鑒定方式主要是通過形態(tài)學(xué)（電子顯微鏡技術(shù)）,、粒子大小以及標(biāo)志蛋白等方式實(shí)現(xiàn)的。

外泌體提取在短時(shí)間（一周之內(nèi)）使用,，可以放在4度保存,，如果長(zhǎng)時(shí)間保存可以放在-20度或-80度保存。也可以將外泌體進(jìn)行分裝,，分別放在-20度或-80度,。外泌體檢測(cè)方法：外泌體分離之后，需要經(jīng)過一系列鑒定才能確定分離的是外泌體,。鑒定方法從物理特征到表面分子標(biāo)志物,，多角度進(jìn)行鑒定。l,、透射電鏡鑒定法：簡(jiǎn)稱TEM,，適合外泌體雙層囊膜超微結(jié)構(gòu)觀察，即通常為茶托型或一側(cè)凹陷的半球形,。2,、納米顆粒追蹤分析法：簡(jiǎn)稱NTA，該方法能保證外泌體原始狀態(tài),、檢測(cè)速度快,，檢測(cè)后能提供外泌體粒徑和濃度信息。

免疫印跡或蛋白質(zhì)印跡是分析外泌體較常用的方法之一,，其原理是外泌體上特異性抗原與抗體結(jié)合,。首先對(duì)樣品進(jìn)行處理將囊泡裂解并將蛋白質(zhì)變性，變性后,，通過SDS-PAGE分離蛋白質(zhì),，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上并暴露于針對(duì)目的抗原的抗體中?？贵w特異性識(shí)別膜表面上的抗原,，然后將膜暴露于第二抗體中。通過二抗的熒光標(biāo)簽或與二抗偶聯(lián)的辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶基團(tuán)進(jìn)行檢測(cè),。常用的標(biāo)記蛋白為CD63,、CD81,、TSG101和ALIX等,。但是此方法的特異性和重復(fù)性會(huì)受到所用抗體質(zhì)量的限制。外泌體的直徑比微泡的要小,，后者直徑為100nm-1μm,。外泌體能夠穿過血腦屏障以將特定藥物輸送到中樞的神經(jīng)系統(tǒng)是外泌體遞送藥物的一個(gè)明顯優(yōu)勢(shì)。

外泌體中常見的細(xì)胞質(zhì)蛋白是Rabs蛋白,，是鳥苷酸三磷酸酶家族的一種,。它可以調(diào)節(jié)外泌體膜與受體細(xì)胞的融合,，有文獻(xiàn)報(bào)道稱RAB4,RAB5和RAB11主要出現(xiàn)在早期以及回收的核內(nèi)體中，RAB7和RAB9主要出現(xiàn)在晚期的核內(nèi)體?，F(xiàn)有大量的研究發(fā)現(xiàn)外泌體中含有40種RAB蛋白,。除了RAB蛋白，外泌體中富含具有外泌體膜交換以及融合作用的膜聯(lián)蛋白（包括膜聯(lián)蛋白1,、2,、4、5,、6,、7、11等）,。外泌體膜上富含參與外泌體運(yùn)輸?shù)乃目缒さ鞍准易澹–D63,CD81和CD9)）,、熱休克蛋白家族（(HSP60,HSP70,HSPA5,CCT2和HSP90以及一些細(xì)胞特異性的蛋白包括A33（結(jié)腸上皮細(xì)胞來源）、MHC-Ⅱ(抗原提呈細(xì)胞來源),、CD86(抗原提呈細(xì)胞來源)以及乳凝集素,。外泌體的提取的方式：密度梯度離心法。方法外泌體提取

外泌體的存在：外泌體幾乎存在于所有的組織,、細(xì)胞間隙,、體液中。羊水提取試劑盒廠家

PEG沉淀法分離外泌體：通常通過將無水聚合物,，如聚乙二醇（PEG）,，與樣品混合來沉淀外泌體。PEG聚合物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合水分子,，增加疏水性蛋白和脂質(zhì)分子的相互結(jié)合力從而沉淀外泌體,，然后通過離心分離外泌體。這種分離的方法快速,，簡(jiǎn)便,，可用于各種起始體積（從100μL到幾毫升）適合于各種研究和臨床設(shè)定。然而,，這種方法缺乏選擇性,，PEG聚合物不只會(huì)導(dǎo)致外泌體小泡沉淀，還會(huì)引起其他細(xì)胞外囊泡,、細(xì)胞外蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體沉淀,。因此，在使用這種方法之前,，必須進(jìn)行樣品預(yù)處理,，例如過濾或超速離心，以減少較終的外泌體制劑的污染。羊水提取試劑盒廠家

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