在多色免疫熒光技術(shù)中，不同顏色的熒光標(biāo)記與不同分子或蛋白質(zhì)的結(jié)合主要通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)：1.特異性抗體選擇：首先,，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要,，選擇能夠特異性識(shí)別目標(biāo)蛋白質(zhì)或分子的抗體。這些抗體是高度特異性的,，能夠與特定的抗原（即蛋白質(zhì)或分子）發(fā)生結(jié)合,。2.熒光標(biāo)記物的偶聯(lián)：隨后，將不同顏色的熒光標(biāo)記物（如熒光染料）偶聯(lián)到抗體上,。這一過(guò)程確保每種抗體都被對(duì)應(yīng)的熒光顏色標(biāo)記,，從而在后續(xù)的步驟中可以通過(guò)顏色來(lái)區(qū)分不同的抗體。3.抗體與抗原的結(jié)合：在樣本制備完成后,，將標(biāo)記了熒光染料的抗體添加到樣本中,。這些抗體會(huì)與樣本中的特定蛋白質(zhì)或分子（即抗原）發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。4.熒光信號(hào)的檢測(cè)：使用熒光顯微鏡觀察樣本,。由于每種抗體都被標(biāo)記了獨(dú)特的熒光顏色,，因此可以通過(guò)熒光顯微鏡同時(shí)檢測(cè)和區(qū)分樣本中的多種不同蛋白質(zhì)或分子。熒光信號(hào)的強(qiáng)度通常與抗原-抗體復(fù)合物的數(shù)量成正比,，從而可以定量評(píng)估蛋白質(zhì)或分子的表達(dá)水平,。多色免疫熒光技術(shù)：同步揭示多種蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布。南京TME多色免疫熒光

多色免疫熒光的總體應(yīng)用思路：多標(biāo)技術(shù)：實(shí)現(xiàn)組織原位上多個(gè)靶標(biāo)的標(biāo)記,，在染色 panel 中設(shè)置相應(yīng)目標(biāo)細(xì)胞的 marker,；實(shí)現(xiàn)對(duì)多個(gè)細(xì)胞類群的識(shí)別和染色（各類淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞,、細(xì)胞因子等），對(duì)靶細(xì)胞的數(shù)量,、空間分布,、相互間位置關(guān)系等進(jìn)行定量；實(shí)現(xiàn)對(duì)樣本Tumor微環(huán)境,、Tumor異質(zhì)性,、Tumor免疫浸潤(rùn)水平的描繪，結(jié)果可以應(yīng)用于不同Tumor亞型 / 不同醫(yī)療方案 / 不同實(shí)驗(yàn)因素干預(yù)的預(yù)后判斷 /醫(yī)療效果評(píng)價(jià) / 免疫應(yīng)答水平差異解析等場(chǎng)景,，并可以聯(lián)合單細(xì)胞測(cè)序,、空間轉(zhuǎn)錄組等組學(xué)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行組織原位上的驗(yàn)證和展示,。常州TME多色免疫熒光掃描優(yōu)化抗體偶聯(lián)熒光染料策略,，以增強(qiáng)多色免疫熒光成像的信噪比和對(duì)比度。

在設(shè)計(jì)多色免疫熒光實(shí)驗(yàn)方案以揭示細(xì)胞間多層次的相互作用和微環(huán)境特征時(shí),，應(yīng)遵循以下步驟：1.明確目標(biāo)：首先,，明確實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)，即要檢測(cè)哪些生物標(biāo)志物,，以及這些標(biāo)志物如何反映細(xì)胞間的相互作用和微環(huán)境特征,。2.選擇合適的熒光染料：選用高質(zhì)量的熒光染料，如Opal系列,，能確保染料具有強(qiáng)而穩(wěn)定的熒光信號(hào),，支持多色標(biāo)記。3.樣本準(zhǔn)備：對(duì)細(xì)胞或組織樣本進(jìn)行適當(dāng)處理,，如切片脫蠟,、抗原修復(fù)等，確?？乖谋┞逗涂蓹z測(cè)性,。4.多色標(biāo)記：通過(guò)多重免疫熒光技術(shù)，對(duì)目標(biāo)生物標(biāo)志物進(jìn)行多色標(biāo)記,，確保每個(gè)標(biāo)記物都能被準(zhǔn)確識(shí)別和區(qū)分,。5.成像與分析：使用多光譜掃描成像系統(tǒng)（如Vectra Polaris）進(jìn)行成像,，結(jié)合圖像分析軟件（如inForm）準(zhǔn)確分離每個(gè)熒光染料的光譜特征，以及分離和去除組織自發(fā)熒光,。6.質(zhì)量控制：確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中每個(gè)步驟的質(zhì)量控制,，如熒光信號(hào)的穩(wěn)定性、圖像分析的準(zhǔn)確性等,，以保證結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性,。

多標(biāo)染色技術(shù)是基于特殊的熒光染料 TSA（酪胺），以多輪單染的方式進(jìn)行,；每一輪染色按一抗 — 二抗 — TSA 的孵育順序?qū)ο鄳?yīng)抗原進(jìn)行標(biāo)記,；標(biāo)記完成后將一抗和二抗在高溫和微波的修復(fù)條件下洗脫，TSA 保留（TSA 與抗原以共價(jià)鍵結(jié)合,，抗原抗體以離子鍵結(jié)合,，修復(fù)條件下離子鍵斷裂，共價(jià)鍵留存）,；經(jīng)過(guò)多輪這樣的準(zhǔn)確標(biāo)記與洗脫循環(huán),，不同的抗原可以被不同的熒光標(biāo)記所標(biāo)識(shí)，在單一的樣本上實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)的同時(shí)可視化,，這對(duì)于理解復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境,、疾病進(jìn)展機(jī)制以及藥物作用靶點(diǎn)的鑒定具有重要意義。從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核,，多色熒光有效解析細(xì)胞結(jié)構(gòu),。

進(jìn)行多色標(biāo)記以揭示細(xì)胞間相互作用和微環(huán)境特征時(shí)，為平衡不同熒光通道之間的光毒性差異至關(guān)重要,，要注意以下事項(xiàng)：1.選擇合適的熒光染料：優(yōu)先選擇光穩(wěn)定性好,、光毒性低的熒光染料，以減少對(duì)樣本的損傷,。2.優(yōu)化激發(fā)光源：使用低強(qiáng)度,、長(zhǎng)波長(zhǎng)的激發(fā)光源，減少對(duì)樣本的光照時(shí)間和強(qiáng)度,，降低光毒性,。3.減少激發(fā)波長(zhǎng)重疊：盡量選擇激發(fā)波長(zhǎng)差異較大的熒光染料，避免激發(fā)光在多個(gè)通道間重疊,，降低不必要的曝光,。4.采用順序掃描：使用序列掃描方法，即按順序激發(fā)不同熒光染料并分別采集熒光信號(hào),，以減少同時(shí)激發(fā)多個(gè)熒光染料時(shí)產(chǎn)生的光毒性,。5.控制成像條件：在成像過(guò)程中，控制曝光時(shí)間、增益等參數(shù),，確保熒光信號(hào)的強(qiáng)度足夠且不會(huì)對(duì)樣本造成過(guò)度損傷,。優(yōu)化標(biāo)記策略，平衡染料亮度與穩(wěn)定性,，對(duì)于長(zhǎng)期追蹤實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要,。江蘇病理多色免疫熒光TAS技術(shù)原理

高靈敏度探測(cè)器與高級(jí)光學(xué)濾鏡，助力捕捉弱熒光信號(hào),，提升圖像質(zhì)量,。南京TME多色免疫熒光

通過(guò)多色免疫熒光技術(shù)結(jié)合細(xì)胞微環(huán)境分析，可以深入探討Tumor細(xì)胞與其周圍基質(zhì)細(xì)胞的相互作用機(jī)制,，具體步驟如下：1.多色標(biāo)記：利用多色免疫熒光技術(shù),，選擇特異性抗體標(biāo)記Tumor細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞中的關(guān)鍵分子，實(shí)現(xiàn)不同組分的多色來(lái)區(qū)分,。2.細(xì)胞微環(huán)境分析：對(duì)標(biāo)記后的細(xì)胞進(jìn)行成像,，結(jié)合組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞分布，分析Tumor細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞之間的相對(duì)位置和空間關(guān)系,。3.分子互作檢測(cè)：觀察標(biāo)記分子的共定位情況,，結(jié)合熒光強(qiáng)度變化,，評(píng)估Tumor細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞間可能存在的分子互作,。4.定量與統(tǒng)計(jì)分析：利用圖像處理軟件對(duì)成像數(shù)據(jù)進(jìn)行定量和統(tǒng)計(jì)分析，如細(xì)胞間距離,、分子表達(dá)水平等,，揭示Tumor細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞相互作用的程度和模式。南京TME多色免疫熒光