蛋白質(zhì)乙?；揎椊M學(xué)定量分析：1. SILAC細(xì)胞標(biāo)記,，組織/細(xì)胞破碎，提取,、提純目的蛋白質(zhì)（基于SILAC的乙?；揎椊M學(xué)定量）。2. 使用胰蛋白酶將目的蛋白酶解成多肽片段,。3. 對多肽片段進(jìn)行iTRAQ標(biāo)記（基于iTRAQ的乙?；揎椊M學(xué)定量）。4. 使用高效特異性乙?；贵w對乙?；揎楇亩芜M(jìn)行免疫富集。5. 使用LC-MS/MS對富集的乙?；亩芜M(jìn)行序列分析,。6. 數(shù)據(jù)分析，比對不同樣本中蛋白乙?；揎椝讲町?，并對產(chǎn)生變化的生物學(xué)意義進(jìn)行解釋。蛋白質(zhì)修飾可檢測修飾類型有磷酸化,、糖基化,、乙酰化,、泛素化,、丙酰化,、丁?；⒈,；?。北京泛素化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)主要方式
蛋白質(zhì)翻譯后修飾：蛋白質(zhì)的翻譯后修飾通過可逆的共價鍵將小分子或蛋白質(zhì)與底物蛋白質(zhì)上特定的氨基酸結(jié)合，調(diào)控著底物的酶活性,、功能以及三級結(jié)構(gòu)的變化,。各種蛋白質(zhì)翻譯后修飾在信號通路和網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮著重要的作用，翻譯后修飾系統(tǒng)的紊亂將導(dǎo)致一系列疾病的發(fā)生,。通過實驗的方法鑒定蛋白質(zhì)翻譯后修飾的位點需要耗費大量的資金和時間,，并且酶反應(yīng)的優(yōu)化常常難以實現(xiàn)。而計算的方法則能夠快速,、準(zhǔn)確的預(yù)測酶特異性的底物蛋白質(zhì)及其修飾位點,。南京琥珀酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)一般流程泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位,。
蛋白質(zhì)有哪些翻譯后修飾,？作用機(jī)制和生物學(xué)功能是什么？前體蛋白是沒有活性的,，常常要進(jìn)行一個系列的翻譯后加工,，才能成為具有功能的成熟蛋白。加工的類型是多種多樣的,，一般分為以下幾種：N-端fMet或Met的切除,、二硫鍵的形成、化學(xué)修飾和剪切,。當(dāng)合成蛋白質(zhì)時,，20種不同的氨基酸會組合成為蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的翻譯后蛋白質(zhì)其他的生物化學(xué)官能團(tuán)（如醋酸鹽,、磷酸鹽,、不同的脂類及碳水化合物）會附在蛋白質(zhì)上從而改變蛋白質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)，或是造成結(jié)構(gòu)的改變（如建立雙硫鍵）,，來擴(kuò)闊蛋白質(zhì)的功能,。再者，酶可以從蛋白質(zhì)的N末端移除氨基酸,，或從中間將肽鏈剪開,。舉例來說，胰島素它會在建立雙硫鍵后被剪開兩次,，并在鏈的中間移走多肽前體,，而形成的蛋白質(zhì)包含了兩條以雙硫鍵連接的多肽鏈。
蛋白質(zhì)磷酸化修飾定義,？在哺乳動物細(xì)胞生命周期中,，大約有1/3的蛋白質(zhì)發(fā)生過磷酸化修飾，在脊椎動物基因中,，約有5%的基因編碼的蛋白質(zhì)是參與磷酸化和去磷酸化過程的蛋白激酶和磷酸酶,。它可以通過激發(fā)、調(diào)節(jié)諸多信號通路進(jìn)而參與調(diào)控生物體的生長,、發(fā)育,、逆境應(yīng)激,、疾病發(fā)生等多種生命過程，一直是生物學(xué)研究的重點與熱點,。蛋白磷酸化是指在激酶催化作用下把ATP或者GTP的磷酸基團(tuán)（P04）轉(zhuǎn)移到不同種類的氨基酸上（主要包括絲氨酸S,、蘇氨酸T、酪氨酸Y）,，從而使蛋白質(zhì)發(fā)生翻譯后修飾的過程,。蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)具有可靠性。
蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學(xué)：磷酸化蛋白質(zhì)是由蛋白激酶將ATP或GTP分子上的磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的氨基酸側(cè)鏈上形成的,。蛋白質(zhì)磷酸化是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾,。在哺乳動物的細(xì)胞生命周期中，至少有三分之一的蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾,。磷酸化修飾參與許多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和細(xì)胞代謝過程,，且許多已知的疾病也與蛋白質(zhì)的異常磷酸化有關(guān)。因此,，對磷酸化蛋白質(zhì)組進(jìn)行定量研究,，尋找差異表達(dá)的磷酸化蛋白質(zhì)，有助于發(fā)現(xiàn)疾病的生物標(biāo)志物和尋找新的具有診療潛力的藥物靶標(biāo),。常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括泛素化,。浙江丙酰化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究
常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾包括糖基化,。北京泛素化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)主要方式
蛋白磷酸化檢測方法：一,、Western Blot檢測方法優(yōu)勢：1. WB方法簡便，多數(shù)實驗室具備Western Blot設(shè)備條件,。2. 許多磷酸化抗體十分靈敏,，能夠檢測低至10ug的蛋白樣品。3. 對于豐度低的蛋白,，可以先通過IP使用目標(biāo)蛋白的抗體對目標(biāo)蛋白進(jìn)行富集,，再進(jìn)行WB檢測被磷酸化的蛋白，檢測效率可以提高幾倍甚至幾十倍,。二,、質(zhì)譜檢測方法：Western Blot的方法雖然簡便，但是對于大規(guī)模分析復(fù)雜的生物樣品的磷酸化水平就不再適用了,。而質(zhì)譜卻能很好的解決這一問題,。依靠高準(zhǔn)確度質(zhì)譜儀，如今快速準(zhǔn)確分析細(xì)胞中高豐度蛋白的磷酸化修飾已是非常簡單的事,。具體的檢測方法為先通過SDS-PAGE膠,，或者2D-PAGE膠等分離目標(biāo)蛋白，將含有目標(biāo)蛋白的條帶切下,，胰酶消化,，LC-MS/MS檢測分析蛋白序列和相應(yīng)位點的磷酸化修飾,。這個方法適用于同時檢測多個目標(biāo)蛋白的磷酸化水平。北京泛素化修飾蛋白質(zhì)組學(xué)主要方式
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