免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性,，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS,。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光,，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光，則為特異性陽性染色,。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,，隨著時(shí)間的延長,，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降,。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè),。IL-6免疫檢測(cè)

熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm,，較大發(fā)射光波長520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水,，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。IL-6免疫檢測(cè)免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選。

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）,；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）,；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色），可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量,。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基,，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min,。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,，進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定20分鐘,。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細(xì)胞通透。5) 除去Triton X-100,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）,。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度）,，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測(cè)定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì),、多肽,、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體,、細(xì)胞因子,、細(xì)胞表面抗原、肉瘤標(biāo)志物,、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病,、內(nèi)分泌,、藥物檢測(cè)、免疫學(xué),、血型鑒定等,。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估,。cytokeratin18(CK18)免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用,。IL-6免疫檢測(cè)

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。四乙基羅丹明（rhodamine，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水,，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光,。IL-6免疫檢測(cè)

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