免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)），0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對(duì)胞內(nèi)抗原,，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）,；除了TritonX-100,，也可作為通透劑,，并且固定后的樣品不需要通透,。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點(diǎn)進(jìn)行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min,，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清,、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕,，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。醛類固定的樣品,，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。CK7免疫熒光試驗(yàn)

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液,，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時(shí)添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中,。FITC免疫熒光IF熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法,。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,，以排除某些非特異性熒光染色的干擾,。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L，pH7.4的PBS,。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體,，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體。③陽性對(duì)照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無熒光或弱熒光,，陽性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,，則為特異性陽性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長,，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降,。

細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過程中，需要用到細(xì)胞爬片,，通過將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光,。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大；與直接免疫熒光相比,，通過信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗，37℃,，室溫避光孵育1小時(shí),。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行,。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核，一般為藍(lán)色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次，每次 5 min，洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程,。細(xì)胞免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。CK7免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1,、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會(huì)產(chǎn)生背景熒光，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察,，確?？乖旧頉]有信號(hào)。2,、陽性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理，結(jié)果應(yīng)為陽性,，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠,。3、陰性對(duì)照：與陽性對(duì)照相反,，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色,，結(jié)果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。CK7免疫熒光試驗(yàn)

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