細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細胞懸液,，計數(shù),。2)取細胞培養(yǎng)12孔板，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細胞懸液時爬片漂起,，造成雙層細胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后,，根據(jù)細胞生長速度快慢，觀察判斷細胞密度,，約90%時進行細胞免疫熒光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。LY6G免疫熒光分析

免疫熒光間接法測抗體實驗注意事項：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h,，時間過長，會使熒光減弱,。2）每次試驗時,，需設(shè)置以下三種對照：①陽性對照：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個步驟中，始終保持濕潤,，避免干燥,。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失,，從而造成非特異性熒光染色。Aggrecan免疫組化IHC免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置,。

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合,，并使用成像顯微鏡觀察,。直接免疫熒光的優(yōu)點：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題,。與間接免疫熒光相比,，時間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點：不允許通過二抗進行信號放大,；檢測靈敏度降低,；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測相比,，更昂貴,。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進行免疫染色并檢測目標(biāo)蛋白。首先,，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白,。然后，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個以上的二抗可以與一抗結(jié)合,，熒光信號被放大,，提供了更高的檢測靈敏度。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進行標(biāo)記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù),。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù),，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學(xué)技術(shù),。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì),、細胞因子,、細胞表面抗原、多肽,、核酸,、受體、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測,、免疫學(xué)、血型鑒定等,。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次,。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據(jù)說明書使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片,。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,。SERPINF1免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。LY6G免疫熒光分析

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低,，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,，影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右）,，高于37℃可加強染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間,。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。LY6G免疫熒光分析

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