細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板），為后面照像打基礎(chǔ),。細(xì)胞密度適中,，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗,；4. 0.1%Triton作用20分鐘；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗，4度孵育過(guò)夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái),，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻,。抗體稀釋度1：60,，較常用,！8. PBS沖洗4次，各5分鐘,；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400,，較常用,！10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿，多封幾次才有體會(huì),。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。VEGFR2免疫熒光試驗(yàn)

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題:1,、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說(shuō)明書的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時(shí)間不合適,，建議 4 ℃ 過(guò)夜孵育,。2、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過(guò)高,；抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高；清洗不充分,；樣本變干,，染色過(guò)程確保樣品始終浸沒(méi)于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。CD42b免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達(dá)水平,。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍，可以測(cè)定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì),、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原,、多肽,、核酸、受體,、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測(cè),、免疫學(xué)、血型鑒定等,。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次,。封閉：使用封閉液對(duì)樣本進(jìn)行封閉，一般1h,。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過(guò)夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時(shí)需要加二抗處理,，根據(jù)說(shuō)明書使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察,。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個(gè)定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)提供一個(gè)明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高,、速度快的特點(diǎn)，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來(lái)顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。免疫熒光技術(shù)通過(guò)熒光信號(hào)的觀察來(lái)確定抗原或抗體的分布和定位,。

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng),、敏感性高、速度快,。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問(wèn)題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同,，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無(wú)放射性污染,，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣,。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn),。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題,，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定,，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣,，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用,。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景。VEGFR2免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光技術(shù)中,，以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的方法被稱為熒光抗體技術(shù),。VEGFR2免疫熒光試驗(yàn)

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí),。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3,。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘,。7. 一抗,，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度,，1-2小時(shí),。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時(shí),。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí),，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間,，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí),。VEGFR2免疫熒光試驗(yàn)

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