基于熒光成像的技術對于查詢細胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用,。當與免疫化學結(jié)合時,，熒光成像技術的分析能力增加，增強了這種技術在普遍的研究和臨床應用中的實用性,，使其成為寶貴的工具,。免疫熒光顯微鏡通過使活細胞成像能夠可視化整個細胞器，徹底改變了細胞生物學領域,。免疫組織化學和免疫細胞化學是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進行細胞分析的常用熒光成像技術,。免疫熒光（IF）是一種強大的免疫染色技術，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標分子結(jié)合的熒光素標記抗體,。免疫熒光用于鑒定細胞中的細胞和組織特異性抗原,；可視化蛋白質(zhì)的存在與否、細胞定位和活化狀態(tài),；并分析免疫反應,。使用熒光抗體方法是免疫熒光技術中常見的操作步驟。AKT免疫檢測

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應,。由于抗原抗體反應具有高度的特異性,，所以當抗原抗體發(fā)生反應時，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上，與其相應的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應,。在此基礎上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,，經(jīng)過一定時間反應,，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應結(jié)合,，再用熒光標記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應,，形成抗體-抗原-抗體復合物。VEGFR2免疫熒光染色免疫熒光技術是基于免疫學,、生物化學和顯微鏡技術的重要方法之一,。

檢測復雜的生物學結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來,。標準的免疫熒光標記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果,。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細調(diào)整樣品信號達到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù),。雖然熒光基團是進行高質(zhì)量細胞成像的較佳選擇,，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,，即熒光信號的光化學降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,，產(chǎn)生假性結(jié)果,。抗淬滅封片劑可以保護熒光標記蛋白的穩(wěn)定性,，維持數(shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度。

免疫熒光-實驗步驟：細胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔,；18mm12孔,；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min,。免疫熒光技術在免疫學研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關系。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標記抗體而進行抗原定位的技術稱為熒光抗體技術,。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術,，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術很少應用,，所以人們習慣稱為熒光抗體技術,，或稱為免疫熒光技術。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術顯示和檢查細胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細胞（或組織）化學技術,。熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應抗原的方法。IBA-1免疫

免疫熒光技術可以用于研究細胞內(nèi)分子的相互作用,。AKT免疫檢測

熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低。AKT免疫檢測

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