免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度。滴加以0.01mol/L,，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。取出玻片,，置于玻片架上，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過(guò)0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min,，不時(shí)振蕩。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體,。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。重復(fù)操作3,。取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油,，再覆以蓋玻片。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,，結(jié)果判定同直接法,。免疫熒光技術(shù)是一種利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原的技術(shù)。多重免疫熒光分析

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原,，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng),，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥,、封片后鏡檢,。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的,，待檢血清為一抗體,，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,，同于血清球蛋白有種的特異性,，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷,。多重免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分子,，通過(guò)不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h,，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱,。2）每次試驗(yàn)時(shí),，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽(yáng)性對(duì)照：陽(yáng)性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn),，避免干燥,。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失,，從而造成非特異性熒光染色。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時(shí)。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過(guò)夜,，一般要大于18小時(shí)或者37度,，1-2小時(shí)。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時(shí)。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí),，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間,，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí),。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測(cè)定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì)、多肽,、核酸,、神經(jīng)遞質(zhì)、受體,、細(xì)胞因子,、細(xì)胞表面抗原、肉瘤標(biāo)志物,、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病,、內(nèi)分泌,、藥物檢測(cè)、免疫學(xué),、血型鑒定等。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490495nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。多重免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)通過(guò)熒光信號(hào)的觀察來(lái)確定抗原或抗體的分布和定位,。多重免疫熒光分析

熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí),，得到的熒光強(qiáng)度也較大,。多重免疫熒光分析

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