免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織,。對單層生長細胞,，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞,，取對數(shù)生長細胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片,。2.固定：取適當?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月,。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結合,。早期的免疫熒光技術是將抗體與示蹤物質(zhì)結合,，用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。VEGFR2免疫熒光IF

細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃,，室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標記,，因此操作過程盡量在暗處進行,。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復染細胞核，一般為藍色熒光,；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細胞3 次，每次 5 min,，洗去多余的DAPI,。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結合較緊，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應的激發(fā)光源。LY6G免疫組化免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術,。

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術,，是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學,、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結合,，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術,。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功,。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術已相當成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術,。在實際工作中熒光抗原技術很少應用,，所以人們習慣將熒光抗體技術稱為免疫熒光技術

熒光的產(chǎn)生：一此化學物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學能等）而進入激發(fā)態(tài),，當其從激發(fā)態(tài)再回復到基態(tài)時,，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光,；而一旦停止供能,，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。可以引起發(fā)熒光的能量種類很多,，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光,。由化學應所引起的稱為化學熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光,。熒光免疫技術一般應用致熒光物質(zhì)進行標記,。免疫熒光技術是一種利用熒光物質(zhì)標記抗體來定位抗原的技術。

細胞免疫熒光可以觀察蛋白在細胞中的定位,，以及一些特殊信號分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進行細胞免疫熒光過程中，需要用到細胞爬片,，通過將爬片浸在細胞培養(yǎng)基內(nèi),，細胞在爬片上生長，進而進行細胞的免疫熒光,。實驗前準備：1.胰酶;2.DMEM細胞培養(yǎng)基;3.細胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結合的二抗數(shù)量進行信號放大；與直接免疫熒光相比,，通過信號放大提高檢測靈敏度,。免疫熒光技術是一種以熒光素標記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達的標記免疫技術。免疫熒光技術可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常,。VEGFR2免疫熒光IF

免疫熒光技術可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治,。VEGFR2免疫熒光IF

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時,，從孵箱中取出,。2.用預溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜,。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光,。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛,，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋,。VEGFR2免疫熒光IF

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