基于熒光成像的技術(shù)對于查詢細(xì)胞和組織的結(jié)構(gòu)和功能方面非常有用,。當(dāng)與免疫化學(xué)結(jié)合時,，熒光成像技術(shù)的分析能力增加,，增強(qiáng)了這種技術(shù)在普遍的研究和臨床應(yīng)用中的實(shí)用性，使其成為寶貴的工具,。免疫熒光顯微鏡通過使活細(xì)胞成像能夠可視化整個細(xì)胞器,，徹底改變了細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。免疫組織化學(xué)和免疫細(xì)胞化學(xué)是結(jié)合抗原抗體結(jié)合能力進(jìn)行細(xì)胞分析的常用熒光成像技術(shù),。免疫熒光（IF）是一種強(qiáng)大的免疫染色技術(shù),，利用顯微鏡觀察與靶蛋白和其他目標(biāo)分子結(jié)合的熒光素標(biāo)記抗體。免疫熒光用于鑒定細(xì)胞中的細(xì)胞和組織特異性抗原,；可視化蛋白質(zhì)的存在與否,、細(xì)胞定位和活化狀態(tài)；并分析免疫反應(yīng),。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),。BAX免疫

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細(xì)胞爬片時,，動作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎,，影響實(shí)驗進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長過密。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅,。或者放于暗盒內(nèi),，暫時保存于4度冰箱,，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時,，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。BAX免疫免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。

免疫熒光的原理：免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上,，經(jīng)一定的溫度和時間的染色,，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,，室溫下干燥后封片,、鏡檢。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高、速度快的特點(diǎn),，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。免疫熒光技術(shù)可以同時檢測多個目標(biāo)分子,，通過不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍,。注意：有的時候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心,，注意 反正面,，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取,，另外洗的時候加PBS不要太沖,，不要細(xì)胞沖下來。洗的時候我都是多加PBS,，稍晃一下就倒掉,，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,，PBS洗三遍,。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍,。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜,，也可37度2小時,，感覺前者效果好，PBS洗三遍,。6. 二抗室溫2小時(避光),，或者37度1半小時,，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片,，指甲油封片子的四周,，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂,。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原,，也可以用于檢測和定位抗體。BAX免疫

使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟,。BAX免疫

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計、流式細(xì)胞儀和時間分辨熒光計等儀器激光共聚焦顯微鏡,。BAX免疫

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