細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,，同時將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,，標(biāo)記目的靶點。封閉細(xì)胞樣品,，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色,?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究,、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。ALBUMIN免疫熒光IF

細(xì)胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟盡量避光,。縮短在熒光顯微鏡下的觀察時間,，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周,。無/弱染色：烤片溫度過高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過低,，孵育是否時間過短等。GFAP免疫組化IHC在1941年,，Coons初次成功地使用熒光素作為標(biāo)記物質(zhì)進(jìn)行免疫熒光實驗,。

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法,。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后,，利用特殊儀器測定熒光強度而推算被測物濃度的檢測方法,。免疫熒光實驗步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。其優(yōu)點是方法簡便,、特異性高,，非特異性熒光染色少。缺點是敏感性偏低,；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體,。此法常用于細(xì)菌、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢,、皮膚活檢的免疫病理檢查,。

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ),。細(xì)胞密度適中,，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片,。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗,；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗,，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻,?？贵w稀釋度1：60，較常用,！8. PBS沖洗4次,，各5分鐘；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘,。抗體稀釋度1：400,，較常用,！10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,，多封幾次才有體會,。12. 避光保存，或到顯微鏡下觀察,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治,。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對單層生長細(xì)胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細(xì)胞離心甩片機制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖尽Ｒ话阌?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月,。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合,。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系,。AKT免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位,。ALBUMIN免疫熒光IF

細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7,、4 37度 PBS 2小時,。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3,。4. 1%Triton：25 min~30 min、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘,。7. 一抗,，4度過夜，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時,。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時,。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。ALBUMIN免疫熒光IF

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