細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認(rèn)是否需要加入 Triton 進行通透。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達到效果,；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光,?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無/弱染色：烤片溫度過高,，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過低,，孵育是否時間過短等,。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合,，從而實現(xiàn)可視化檢測。CD11B免疫熒光IF

免疫熒光通透（目的是使抗體進入胞內(nèi)）,，0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）,；除了TritonX-100,，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透,。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min,，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清,、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕,，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。醛類固定的樣品,，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉。P-AKT 1/2/3免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選,。

細胞免疫熒光實驗常見問題:1,、信號弱或者無信號：細胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達量進行摸索；3）一抗孵育時間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育,。2、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過高,；抗體孵育時間過長或溫度過高；清洗不充分,；樣本變干,，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。

細胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過氧化物酶,；孵育過程中干片,；抗原熱修復(fù)過度。染色過深：一抗?jié)舛冗^高,；染色試濃度過高或孵育時間過長,；染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透,，但若檢測抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號,；建議設(shè)陰性對照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時,，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高,。熒光抗體技術(shù)可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體,。

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。四乙基羅丹明（rhodamine,，RIB200）為橘紅色粉末，不溶于水,，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的定位和表達水平,。SERPINF1免疫熒光IF

免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實驗技術(shù)，用于檢測和定位特定抗原或抗體,。CD11B免疫熒光IF

免疫熒光的原理：免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時,，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上,，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體,，直接加在抗原標(biāo)本上,，經(jīng)一定的溫度和時間的染色，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,，室溫下干燥后封片,、鏡檢。CD11B免疫熒光IF