熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài),，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時,，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光發(fā)射的特點(diǎn)是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光,；而一旦停止供能,，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失?？梢砸鸢l(fā)熒光的能量種類很多,，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光,，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光,。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制,。CD3免疫組化

免疫熒光-實(shí)驗(yàn)步驟：細(xì)胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔,；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜,。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min,。CD3免疫組化免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系,。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見問題:1,、信號弱或者無信號：細(xì)胞或組織樣本保存時間過長；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索；3）一抗孵育時間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育,。2、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高,；抗體孵育時間過長或溫度過高,；清洗不充分；樣本變干,，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高,、速度快的特點(diǎn)，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光。免疫熒光技術(shù)在生物學(xué)研究,、醫(yī)學(xué)診斷和藥物開發(fā)等領(lǐng)域具有普遍應(yīng)用,。

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打,，使之成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù),。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板,，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上,，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起，防止加細(xì)胞懸液時爬片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi)。3)24h或者48h后,，根據(jù)細(xì)胞生長速度快慢,，觀察判斷細(xì)胞密度，約90%時進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì),。ALP免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活。CD3免疫組化

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等,。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）,、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3應(yīng)用較廣,。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄,，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定。CD3免疫組化