免疫熒光的制作：樣品準備（貼壁細胞,、懸浮細胞以及組織等）：對于貼壁細胞：先將潔凈的蓋玻片在70%乙醇中進行浸泡處理,，然后用干凈無菌的鑷子放置到培養(yǎng)皿中，用無菌PBS洗去殘留的乙醇,。待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，操作小心,，防止細胞脫片。對于懸浮細胞：有2種方法,，①先在懸浮液中進行固定步驟,，然后把細胞滴加在載玻片上，干燥后細胞會緊貼在載玻片上,。②先在懸浮液中進行固定和染色步驟,，離心洗脫，然后用移液管移至盒式玻片進行后續(xù)染色步驟,。對于冷凍切片：切片放置在載玻片上后,，可以直接進行固定等后續(xù)操作。對于石蠟切片：免疫熒光中石蠟切片較少,，要先進行脫蠟和抗原修復處理,。免疫熒光技術可以通過熒光信號顯示和檢查細胞或組織內的抗原或半抗原物質。CD45免疫熒光

細胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向孔內滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃,，室溫避光孵育1小時。注意二抗帶有熒光素標記,，因此操作過程盡量在暗處進行,。吸去二抗，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。向玻片上滴加DAPI，或者Hoechst復染細胞核,，一般為藍色熒光,；避光孵育5-10min。使用PBS輕洗細胞3 次,，每次 5 min,，洗去多余的DAPI。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結合較緊,，張力較大,，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可,。用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上,，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應的激發(fā)光源。CD20免疫熒光檢查免疫熒光是一種常用的生物學實驗技術,，用于檢測和定位特定抗原或抗體,。

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光,；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）,。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅,，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。

免疫熒光技術的主要特點是：特異性強,、敏感性高,、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結果判定的客觀性不足，技術程序也還比較復雜,。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同,，還可進一步分做若干種。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染,，并且大多操作簡便,，便于推廣。國外生產的TDM用試劑盒，有相當一部分即屬于此類,，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定,，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應用,。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術的范疇,。

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔,，防止將細胞爬片夾碎,，影響實驗進程。（2）種細胞過程中,，要注意將細胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密,。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后,，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅?；蛘叻庞诎岛袃?，暫時保存于4度冰箱，盡快拍照,。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時,，要根據熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色,，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。在實際工作中，熒光抗原技術應用較少,，因此通常將其稱為熒光抗體技術或免疫熒光技術,。CD20免疫熒光檢查

免疫熒光技術可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。CD45免疫熒光

細胞和組織樣品處理：準備熒光標記的細胞樣品：為實現較佳的圖像質量,，首先應建立針對目的蛋白和細胞結構的研究,，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細胞樣品用于標記–首先將細胞結構,、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內部，標記目的靶點,。封閉細胞樣品,，防止熒光標記物與研究無關的蛋白非特異性結合，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色,?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結合,。CD45免疫熒光