免疫熒光實驗步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織,。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時,，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次,；對懸浮生長細(xì)胞,，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖尽Ｒ话阌?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月,。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合,。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系,。F4/80免疫熒光IF

免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測定相反）,；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位,，以及利用定量技術(shù)測定含量,。F4/80免疫熒光IF免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實現(xiàn)可視化檢測,。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細(xì)胞爬片時,，動作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎,，影響實驗進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長過密。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅,。或者放于暗盒內(nèi),，暫時保存于4度冰箱,，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時,，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。

免疫熒光間接法測抗體實驗步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度,。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。取出玻片，置于玻片架上,，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次，然后按順序過0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min,，不時振蕩。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體,。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min。重復(fù)操作3,。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油,，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法,。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測時,，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號,。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)研究中具有普遍的應(yīng)用前景,。F4/80免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選。F4/80免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)的主要特點是：特異性強(qiáng),、敏感性高,、速度快。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結(jié)果判定的客觀性不足,，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜,。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種,。與放射免疫法相比,，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡便,，便于推廣,。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類,，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn),。由于一般熒光測定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定,，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗中應(yīng)用,。F4/80免疫熒光IF