細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ),。細(xì)胞密度適中,，大約60-75%滿(mǎn)片即可,，否則容易脫片,。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗,；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗,，4度孵育過(guò)夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái)，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻,?？贵w稀釋度1：60，較常用！8. PBS沖洗4次,，各5分鐘,；9加入熒光二抗，室溫30分鐘,?？贵w稀釋度1：400，較常用,！10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿，多封幾次才有體會(huì),。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察。免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制,。ZO-1免疫抗體

免疫熒光技術(shù)又稱(chēng)熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù),。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功,。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱(chēng)熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱(chēng)熒光抗原法,。這兩種方法總稱(chēng)免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱(chēng)為免疫熒光技術(shù)ALP免疫抗體免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。

檢測(cè)復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號(hào)，并將熒光信號(hào)從背景噪聲中分離開(kāi)來(lái),。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果,。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號(hào)達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù),。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇,，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號(hào)的光化學(xué)降解或衰退,。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,，產(chǎn)生假性結(jié)果,。抗淬滅封片劑可以保護(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號(hào)完整度,。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱(chēng)熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù),。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。在實(shí)際工作中,，熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少，因此通常將其稱(chēng)為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù),。

細(xì)胞免疫熒光：細(xì)胞種板與細(xì)胞爬片制備：1) 細(xì)胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細(xì)胞后重懸細(xì)胞于完全培養(yǎng)基中，充分吹打,，使之成單細(xì)胞懸液,，計(jì)數(shù)。2)取細(xì)胞培養(yǎng)12孔板,，在每個(gè)孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個(gè)孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上,，壓緊，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細(xì)胞懸液時(shí)爬片漂起,，造成雙層細(xì)胞貼片。根據(jù)自己的需要選擇合適的細(xì)胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后,，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)速度快慢，觀察判斷細(xì)胞密度,，約90%時(shí)進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞分裂和細(xì)胞周期,。CK7即用免疫熒光檢查

免疫熒光技術(shù)可以用于研究代謝疾病和內(nèi)分泌系統(tǒng)的功能。ZO-1免疫抗體

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等,。鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3）,、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3應(yīng)用較廣,。Eu3螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄,，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng),，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定。ZO-1免疫抗體