免疫熒光通透（目的是使抗體進入胞內）,，0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內抗原，若是細胞膜上表達的抗原則省略該步驟）,；除了TritonX-100,，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透,。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進行結合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min,，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加山羊血清,，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清、BSA或者是羊血清,。從封閉開始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕，避免樣品的干燥,，否則極易產生較高的背景,。醛類固定的樣品，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進行封閉,。免疫熒光技術可以用于研究疾病的發(fā)生機制和醫(yī)治效果評估,。F4/80免疫熒光

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次,，每次 5 min,。2)向孔內加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定,，室溫固定20分鐘,。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。4)向孔內加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細胞通透。5) 除去Triton X-100,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）,。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據抗體說明書推薦濃度,，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度）,，4℃濕盒內孵育過夜。F4/80免疫熒光免疫熒光技術中,，以熒光物質標記抗體來定位抗原物質的方法被稱為熒光抗體技術,。

其他熒光物質：酶作用后產生熒光的物質某些化合物本身無熒光效應，一旦經酶作用便形成具有強熒光的物質,。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm,，發(fā)射光波長為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）,、鋱（Tb3）,、鈰（Ce3）等的螯合物經激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應用較廣,。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬,，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長,，較適合用于分辨熒光免疫測定,。

細胞的固定及免疫熒光：注意事項：（1）取細胞爬片時，動作應輕柔,，防止將細胞爬片夾碎,，影響實驗進程。（2）種細胞過程中,，要注意將細胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃，防止細胞局部生長過密,。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過程中注意避光,。（4）細胞爬片進行免疫熒光之后，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅,。或者放于暗盒內,，暫時保存于4度冰箱,，盡快拍照。（5）在進行熒光顯微鏡拍照時,，要根據熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細胞都染成紅色/藍色，只在凋亡的細胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。免疫熒光技術可以用于研究藥物的靶點和作用機制,。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋度不應超過1：20,，抗體濃度過低，會導致產生的熒光過弱,，影響結果的觀察,。染色的溫度和時間需要根據各種不同的標本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。免疫熒光技術可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用。F4/80免疫熒光

熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應抗原的方法,。F4/80免疫熒光

免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍,，可以測定內分泌、蛋白質,、細胞因子,、細胞表面抗原、多肽,、核酸,、受體、神經遞質,、肉瘤標志物,、血藥濃度等各種生物活性物質,。根據診斷類別，又可分為傳染性疾病,、內分泌,、藥物檢測、免疫學,、血型鑒定等,。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉,，一般1h,。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理,，根據說明書使用合適的濃度，避光處理1h（后面步驟均需避光）,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。封片：滴一滴防淬滅劑，封片,?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察。F4/80免疫熒光