熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加,；與直接免疫熒光相比，時間更長（操作步驟更多）,。間接免疫熒光的優(yōu)點：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進行信號放大,；與直接免疫熒光相比，通過信號放大提高檢測靈敏度,；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時間更長（操作步驟更多）,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞凋亡、細胞增殖和細胞分化等生物學(xué)過程,。S100A4免疫抗體

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7、4 37度 PBS 2小時,。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3,。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘,。7. 一抗,，4度過夜，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時,。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時,。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長PBS清洗時間，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時,。IL-10免疫熒光分析免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),。

細胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細胞結(jié)構(gòu)的研究,，同時將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細胞樣品用于標(biāo)記–首先將細胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細胞內(nèi)部,，標(biāo)記目的靶點。封閉細胞樣品,，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比。蛋白封閉液有助于減少非特異染色,?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合,。

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出,。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。12.95%甘油封片。注：4%甲醛,，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋。在實際工作中,，熒光抗原技術(shù)應(yīng)用較少,，因此通常將其稱為熒光抗體技術(shù)或免疫熒光技術(shù)。

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,。IL-10免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,，通過抗原抗體反應(yīng)進行定位。S100A4免疫抗體

細胞免疫熒光實驗注意事項：根據(jù)所檢測抗原所在位置來確認是否需要加入 Triton 進行通透,。若所檢測抗原表位位于膜蛋白的白外段,，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達到效果,；從加熒光二抗起,，后面所有操作步驟盡量避光,?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時間，1~2 h 為宜,。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周,。無/弱染色：烤片溫度過高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過低，孵育是否時間過短等,。S100A4免疫抗體