免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片,，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度,。滴加以0.01mol/L,，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min。取出玻片,，置于玻片架上,，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min,，不時(shí)振蕩,。取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，但不使標(biāo)本干燥,，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。重復(fù)操作3。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,，結(jié)果判定同直接法。免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1,、建議細(xì)胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時(shí)造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果,；2、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片,。建議直接購(gòu)買處理過的細(xì)胞爬片；若只有普通細(xì)胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng),，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜,，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片,，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺(tái)造紫外消毒后備用。CD68免疫熒光分析使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見的操作步驟,。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí),。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3,。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘。7. 一抗,，4度過夜,，一般要大于18小時(shí)或者37度，1-2小時(shí),。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時(shí),。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí),。

熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）,。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大,；與直接免疫熒光相比，通過信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度,；熒光標(biāo)記二抗的選擇普遍,；與使用熒光素結(jié)合一抗的檢測(cè)相比，成本較低,。間接免疫熒光的缺點(diǎn)：由于需要具有兩種不同物種反應(yīng)性的兩種抗體,，因此物種交叉反應(yīng)性問題增加；與直接免疫熒光相比,，時(shí)間更長(zhǎng)（操作步驟更多）,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù)。

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h,，時(shí)間過長(zhǎng)，會(huì)使熒光減弱,。2）每次試驗(yàn)時(shí),，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤(rùn),，避免干燥,。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失,，從而造成非特異性熒光染色。熒光抗體技術(shù)可用于檢測(cè)和定位各種抗原,，也可以用于檢測(cè)和定位抗體,。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查

使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù)。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍,。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心,，注意 反正面,，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取,，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,，不要細(xì)胞沖下來。洗的時(shí)候我都是多加PBS,，稍晃一下就倒掉,，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍,。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時(shí),，感覺前者效果好,，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光),，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍,。7. 較好用DAPI染核,，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS,，甘油封片,，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干,，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂,。osteocalcin(ocn)免疫熒光檢查