免疫熒光檢測相對于酶檢測的優(yōu)勢：定量熒光信號的能力（與使用基于酶的方法進行的定性測定相反）,；復用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來檢測多種蛋白質(zhì)）；熒光染料的光穩(wěn)定性,。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細胞內(nèi)形成的抗原抗體復合物上含有標記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,，以及利用定量技術(shù)測定含量,。免疫熒光技術(shù)可以同時檢測多個目標分子，通過不同顏色的熒光染料進行標記,。OPN免疫熒光分析

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強度）。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強度,，除受激發(fā)光強度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān),。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,，得到的熒光強度也較大。OPN免疫熒光分析熒光抗體標記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細胞結(jié)構(gòu)和功能,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍。它們不會損傷活細胞,，可安全用于生物制劑,。在進行免疫熒光檢測時，首先對細胞或組織進行固定和透化處理,。進行免疫染色時,，熒光團與目標抗原的抗體結(jié)合，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號,。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。

細胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍,。注意：有的時候作的細胞爬片可能比較小,，因此夾取的時候要小心，注意 反正面,，放在皿里洗比較方便,，避免了來回夾取，另外洗的時候加PBS不要太沖,，不要細胞沖下來,。洗的時候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉,，沒有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍,。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時,，感覺前者效果好,，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(避光),，或者37度1半小時,，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片,，指甲油封片子的四周,，因為甘油不象樹脂那樣會干，所以不用指甲油封的話會弄的一塌糊涂,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全,。

細胞免疫熒光實驗注意事項：1、建議細胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果；2,、若實驗室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細胞植于細胞爬片,。建議直接購買處理過的細胞爬片；若只有普通細胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強,，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜,，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟,。然后,，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病,。COX2免疫熒光

免疫熒光技術(shù)在生物醫(yī)學研究中具有普遍的應(yīng)用前景,。OPN免疫熒光分析

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學,、生物化學和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。OPN免疫熒光分析