zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出,。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。7.5%BSA室溫封閉30分鐘。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里，4度過夜。9.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光,。11.1×PBS洗3次，每次10分鐘。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛,，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞內(nèi)分子的相互作用。klf8免疫熒光分析

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時間的照射后會減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射,。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍,、堿性復(fù)紅。伊文思藍或低濃度的過錳酸鉀、碘溶液等對標本進行得當復(fù)染,，以減弱非特異性熒光本質(zhì)，使特異熒光更突出顯示,。P62免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱，影響結(jié)果的觀察,。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化,，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強染色效果，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長染色時間,。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7、2-7,、4 37度 PBS 2小時,。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度，20分鐘,。7. 一抗,，4度過夜,，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時,。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時,。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時,。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術(shù)的范疇。

免疫熒光間接法測抗體實驗步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標本片,，10min后棄去，使標本片保持一定濕度,。滴加以0.01mol/L,，pH7.4的PBS適當稀釋的待檢抗體標本，覆蓋已知抗原標本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min。取出玻片,，置于玻片架上,，先用0.01mol/L，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min,，不時振蕩,。取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，但不使標本干燥,，滴加一滴一定稀釋度的熒光標記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。重復(fù)操作3,。取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法,。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。Insulin(INS)免疫熒光檢查

熒光抗體標記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細胞結(jié)構(gòu)和功能,。klf8免疫熒光分析

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時,，只要知道其中的一個因素，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上,，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法。直接法：將標記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,，經(jīng)過一定時間反應(yīng),，即可結(jié)合并顯色。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合,，再用熒光標記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng),，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物,。klf8免疫熒光分析