細胞免疫熒光實驗注意事項：1,、建議細胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果,；2,、若實驗室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細胞植于細胞爬片,。建議直接購買處理過的細胞爬片,；若只有普通細胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強,，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜,，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡,，則不需要此步驟。然后,，用洗潔精搓洗爬片,，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干,，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用,。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。AIRE-1免疫熒光染色

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì),、細胞因子、細胞表面抗原,、多肽,、核酸、受體,、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病,、內(nèi)分泌、藥物檢測,、免疫學(xué),、血型鑒定等。免疫熒光實驗步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次,。封閉：使用封閉液對樣本進行封閉,，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。加二抗：使用間接法時需要加二抗處理，根據(jù)說明書使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片,。可立即觀察后暫存4℃盡快觀察,。VEGFA免疫熒光免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實驗技術(shù),，用于檢測和定位特定抗原或抗體。

免疫熒光的原理：免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng),。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體，直接加在抗原標(biāo)本上,，經(jīng)一定的溫度和時間的染色,，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片,、鏡檢,。

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率,、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年,，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色,。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm,，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細胞和分子的功能和相互關(guān)系。

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細胞結(jié)構(gòu)和功能,。AIRE-1免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細胞信號傳導(dǎo)和信號通路。AIRE-1免疫熒光染色

細胞免疫熒光：細胞種板與細胞爬片制備：1) 細胞密度在90%-95%左右,，用預(yù)熱胰酶消化細胞后重懸細胞于完全培養(yǎng)基中,，充分吹打，使之成單細胞懸液,，計數(shù),。2)取細胞培養(yǎng)12孔板，在每個孔放爬片的位置根據(jù)爬片的大小,，先在每個孔里準(zhǔn)備放爬片的位置滴幾滴培養(yǎng)基,，然后將爬片置于液滴上，壓緊,，使爬片與培養(yǎng)皿靠培養(yǎng)基的張力粘合到一起,，防止加細胞懸液時爬片漂起，造成雙層細胞貼片,。根據(jù)自己的需要選擇合適的細胞密度種入12孔板培養(yǎng)板內(nèi),。3)24h或者48h后，根據(jù)細胞生長速度快慢,，觀察判斷細胞密度,，約90%時進行細胞免疫熒光。AIRE-1免疫熒光染色