注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液,，避光室溫孵育10min。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍(lán)光,；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）,。兩種抗體同時(shí)孵育：由于FIT容易萃滅,，因此在孵育抗體時(shí)后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位,。CD11B免疫檢測

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散）,，固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）,；交聯(lián)劑（4%PFA,、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,，不過,，目前甲醛用的還是較多的，但針對磷酸化的抗體,，不適合用甲醛,，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇,，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類型,，對于大多數(shù)組織,，18-24h較為理想，細(xì)胞固定時(shí)間較短,，一般2%的甲醛室溫固定20min即可,。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。COL-2免疫熒光檢查免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測和定位特定抗原或抗體,。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織,。對單層生長細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí),，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次,；對懸浮生長細(xì)胞,，取對數(shù)生長細(xì)胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖尽Ｒ话阌?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月,。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合,。

免疫熒光注意事項(xiàng)：對照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1,、內(nèi)源性組織背景對照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會(huì)產(chǎn)生背景熒光，對結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前，應(yīng)對樣品進(jìn)行觀察,，確保抗原本身沒有信號(hào),。2,、陽性對照：用確認(rèn)含有待測抗原的組織或細(xì)胞,，與待測標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性,，可證明待測抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠,。3,、陰性對照：與陽性對照相反,，用明確不含有待測抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法,。

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功,。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系,。CD11B免疫檢測

免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位,。CD11B免疫檢測

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點(diǎn),。封閉細(xì)胞樣品,，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合,。CD11B免疫檢測