注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm,，發(fā)藍(lán)光,；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555nm,，發(fā)綠光；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm,，發(fā)紅光）。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅,，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。CD11B免疫檢測

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴散）,，固定液包括：有機溶劑（甲醇,、乙醇等）；交聯(lián)劑（4%PFA,、10%中性福爾馬林）,，固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性，不過,，目前甲醛用的還是較多的,，但針對磷酸化的抗體，不適合用甲醛,，會導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,，故應(yīng)選擇冰冷的無水甲醇或無水乙醇，同時應(yīng)注意甲醛會揮發(fā),，在4-8°C不宜儲存太久,。固定時間：取決于組合塊的大小和類型，對于大多數(shù)組織,，18-24h較為理想,，細(xì)胞固定時間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可,。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min,，PBS浸洗玻片3次,，每次3min。COL-2免疫熒光檢查免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實驗技術(shù),，用于檢測和定位特定抗原或抗體,。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對單層生長細(xì)胞,，在傳代培養(yǎng)時,，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對懸浮生長細(xì)胞，取對數(shù)生長細(xì)胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細(xì)胞離心甩片機制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。

免疫熒光注意事項：對照實驗的設(shè)置：1,、內(nèi)源性組織背景對照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會產(chǎn)生背景熒光，對結(jié)果產(chǎn)生影響,，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前，應(yīng)對樣品進(jìn)行觀察,，確?？乖旧頉]有信號。2,、陽性對照：用確認(rèn)含有待測抗原的組織或細(xì)胞,，與待測標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理，結(jié)果應(yīng)為陽性,，可證明待測抗原有一定活性并且實驗過程中用的試劑及方法均可靠,。3、陰性對照：與陽性對照相反,，用明確不含有待測抗原的細(xì)胞或組織切片染色,，結(jié)果若為陰性，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果,。熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法,。

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù),。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功,。經(jīng)過幾十年的發(fā)展,，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。CD11B免疫檢測

免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位,。CD11B免疫檢測

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,，同時將其他一切背景等排除在圖像之外。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定,，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部，標(biāo)記目的靶點,。封閉細(xì)胞樣品,，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色,。抗體能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合,。CD11B免疫檢測