細(xì)胞免疫熒光可以觀察蛋白在細(xì)胞中的定位，以及一些特殊信號(hào)分子蛋白的出核/入核的定位變化,。在進(jìn)行細(xì)胞免疫熒光過(guò)程中,，需要用到細(xì)胞爬片，通過(guò)將爬片浸在細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi),，細(xì)胞在爬片上生長(zhǎng),，進(jìn)而進(jìn)行細(xì)胞的免疫熒光。實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：1.胰酶;2.DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基;3.細(xì)胞培養(yǎng)12孔板或者6孔板;4.爬片,。間接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：通過(guò)增加能夠與一抗結(jié)合的二抗數(shù)量進(jìn)行信號(hào)放大,；與直接免疫熒光相比，通過(guò)信號(hào)放大提高檢測(cè)靈敏度,。免疫熒光技術(shù)是一種以熒光素標(biāo)記抗體來(lái)定位抗原物質(zhì)的高度發(fā)達(dá)的標(biāo)記免疫技術(shù),。免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一,。F4/80免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度,。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。取出玻片,，置于玻片架上，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過(guò)0.01mol/L,，pH7.4的PBS三缸浸泡，每缸5min,，不時(shí)振蕩,。取出玻片，用濾紙吸去多余水分,，但不使標(biāo)本干燥,，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min,。重復(fù)操作3。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，滴加一滴緩沖甘油，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察,，結(jié)果判定同直接法。F4/80免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活,。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：注意事項(xiàng)：（1）取細(xì)胞爬片時(shí),，動(dòng)作應(yīng)輕柔，防止將細(xì)胞爬片夾碎,，影響實(shí)驗(yàn)進(jìn)程,。（2）種細(xì)胞過(guò)程中，要注意將細(xì)胞輕柔混勻,，“八”字或者“十”字形搖晃,，防止細(xì)胞局部生長(zhǎng)過(guò)密。（3）稀釋,、加二抗（熒光抗體）及此后的洗滌過(guò)程中注意避光,。（4）細(xì)胞爬片進(jìn)行免疫熒光之后，需要盡快拍照,，防止免疫熒光淬滅,。或者放于暗盒內(nèi),，暫時(shí)保存于4度冰箱,，盡快拍照。（5）在進(jìn)行熒光顯微鏡拍照時(shí),，要根據(jù)熒光抗體選擇合適的激發(fā)光源,。PI/DAPI能將凋亡和未凋亡的細(xì)胞都染成紅色/藍(lán)色，只在凋亡的細(xì)胞核中才有FITC-12-dUTP摻入而定位的綠色熒光,。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,；孵育過(guò)程中干片,；抗原熱修復(fù)過(guò)度。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高,；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白,，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào),；建議設(shè)陰性對(duì)照組，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時(shí),，保持其新鮮度，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng),，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光,，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等,。2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光,，其中以Eu3+應(yīng)用較廣。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄,，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估,。ERK免疫熒光

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用。F4/80免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測(cè)定內(nèi)分泌,、蛋白質(zhì),、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原,、多肽,、核酸、受體,、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標(biāo)志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測(cè),、免疫學(xué)、血型鑒定等,。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次,。封閉：使用封閉液對(duì)樣本進(jìn)行封閉，一般1h,。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過(guò)夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次。加二抗：使用間接法時(shí)需要加二抗處理,，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察,。F4/80免疫熒光試驗(yàn)