免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細胞,，可安全用于生物制劑。在進行免疫熒光檢測時,，首先對細胞或組織進行固定和透化處理,。進行免疫染色時，熒光團與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號,。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。免疫熒光技術(shù)可以同時檢測多個目標(biāo)分子,，通過不同顏色的熒光染料進行標(biāo)記。Brdu免疫抗體

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3次,，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm,，發(fā)射波長420nm，發(fā)藍光,；FITC激發(fā)波長465-495nm,，發(fā)射波長515-555nm，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長510-560,，發(fā)射波長590nm，發(fā)紅光）,。兩種抗體同時孵育：由于FIT容易萃滅,，因此在孵育抗體時后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光。TNFa免疫抗體免疫熒光技術(shù)可以用于研究食品安全和生物安全,。

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細胞在蓋片上生長融合到95%-100%時，從孵箱中取出,。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光,。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛,，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋。

細胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基,，一般先加入PBS浸洗細胞 3 次,，每次 5 min,。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml，進行細胞固定,，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細胞通透,。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液,，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度）,，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜,。免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以檢測非常低濃度的目標(biāo)分子,。

熒光的產(chǎn)生：一此化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲存能量（如光能,、化學(xué)能等）而進入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時,，過剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）,。熒光發(fā)射的特點是：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能,，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失,。可以引起發(fā)熒光的能量種類很多,，由光激發(fā)所引起的熒光稱為致熒光,。由化學(xué)應(yīng)所引起的稱為化學(xué)熒光，由X線或陰極射線引起的分別稱為X線熒光或陰極射線熒光,。熒光免疫技術(shù)一般應(yīng)用致熒光物質(zhì)進行標(biāo)記,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究神經(jīng)系統(tǒng)的功能和疾病。C-Caspas3免疫檢測

免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程,。Brdu免疫抗體

免疫熒光實驗的注意事項：為了保證熒光染色的正確性,，初次試驗時需設(shè)置下述對照，以排除某些非特異性熒光染色的干擾,。①標(biāo)本自發(fā)熒光對照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS,。②特異性對照（抑制試驗）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。③陽性對照：已知的陽性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對照和特異性對照呈無熒光或弱熒光，陽性對照和待檢標(biāo)本呈強熒光,，則為特異性陽性染色,。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過3min，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察,，隨著時間的延長，熒光強度會逐漸下降,。Brdu免疫抗體