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來(lái)源: 發(fā)布時(shí)間:2023-12-28

細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢,?步驟:1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上(較好可以放入24孔板),為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,大約60-75%滿片即可,,否則容易脫片。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,,現(xiàn)用現(xiàn)配,。(以下各步驟切毋使玻片干燥)3. PBS沖洗;4. 0.1%Triton作用20分鐘,;5. PBS沖洗,;6. 10%正常血清封閉10分鐘;7. 加入一抗,4度孵育過(guò)夜(找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái),,抗體就不容易溢出),,還要記住“砸片”,就是抗體從較高處落到片子上,,以分布均勻,。抗體稀釋度1:60,,較常用,!8. PBS沖洗4次,各5分鐘,;9加入熒光二抗,,室溫30分鐘??贵w稀釋度1:400,,較常用!10. 90%甘油封片,。也很關(guān)鍵阿,,多封幾次才有體會(huì)。12. 避光保存,,或到顯微鏡下觀察,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)通路。CK7免疫

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免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),,是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù),。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種.它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù),。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展,,該技術(shù)已相當(dāng)成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法;用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)collagen1(COL-1)免疫熒光IF免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,,通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位,。

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細(xì)胞的固定及免疫熒光:吸去一抗,,使用PBS浸洗 3 次,每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,,37℃,室溫避光孵育1小時(shí),。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,,因此操作過(guò)程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,,使用PBS浸洗 3 次,,每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,,或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,,一般為藍(lán)色熒光;避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,,每次 5 min,洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,,張力較大,可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,,這樣將爬片輕輕勾起,,用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,,用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,,注意將爬片反過(guò)來(lái)貼于多聚賴氨酸載玻片上,然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,,注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源,。

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致:1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,PBS洗三遍,。注意:有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,,因此夾取的時(shí)候要小心,注意 反正面,,放在皿里洗比較方便,避免了來(lái)回夾取,,另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖,,不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS,,稍晃一下就倒掉,,沒(méi)有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,PBS洗三遍,。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,,PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘,,PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜,也可37度2小時(shí),,感覺(jué)前者效果好,,PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光),,或者37度1半小時(shí),,PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核,,然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS,甘油封片,,指甲油封片子的四周,,因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干,所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答,。

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免疫熒光間接法:如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),,用水洗去未反應(yīng)的抗體,,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物,,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,,干燥、封片后鏡檢,。如果檢查未知抗體,,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為一抗體,,其它步驟的抗原檢查相同,。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,,如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),,因此,制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷,。免疫熒光技術(shù)通過(guò)熒光信號(hào)的觀察來(lái)確定抗原或抗體的分布和定位,。CK7免疫

免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。CK7免疫

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟:1.樣本準(zhǔn)備:細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,,在傳代培養(yǎng)時(shí),,將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,,PBS洗兩次,;對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,,用PBS離心洗滌(1000rpm,5min)2次,,用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定:取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌:PBS洗滌5min*3次,。4.打孔:選擇合適的通透劑處理樣本,,目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。CK7免疫