細(xì)胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細(xì)胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎(chǔ)。細(xì)胞密度適中,，大約60-75%滿片即可，否則容易脫片,。2. 取出細(xì)胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現(xiàn)用現(xiàn)配。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗,；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗,，4度孵育過(guò)夜（找個(gè)小瓶蓋將小玻片支起來(lái)，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”,，就是抗體從較高處落到片子上，以分布均勻,?？贵w稀釋度1：60，較常用,！8. PBS沖洗4次,，各5分鐘；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘,。抗體稀釋度1：400,，較常用,！10. 90%甘油封片。也很關(guān)鍵阿,，多封幾次才有體會(huì),。12. 避光保存，或到顯微鏡下觀察,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)通路,。CK7免疫

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù),。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功,。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟,。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法,；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)collagen1(COL-1)免疫熒光IF免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位,。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃，室溫避光孵育1小時(shí),。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,，因此操作過(guò)程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,，一般為藍(lán)色熒光；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,，每次 5 min，洗去多余的DAPI,。取爬片時(shí)由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個(gè)小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過(guò)來(lái)貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對(duì)應(yīng)的激發(fā)光源,。

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里,，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小,，因此夾取的時(shí)候要小心,，注意 反正面，放在皿里洗比較方便,，避免了來(lái)回夾取,，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來(lái),。洗的時(shí)候我都是多加PBS,，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘,。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘,，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘,，PBS洗三遍,。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍,。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜,，也可37度2小時(shí)，感覺前者效果好,，PBS洗三遍,。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí),，PBS洗三遍,。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片,。8. 蒸餾水洗掉PBS,，甘油封片，指甲油封片子的四周,，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干,，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答,。

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原,，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體,，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng),，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,，干燥,、封片后鏡檢,。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的,，待檢血清為一抗體,，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,，同于血清球蛋白有種的特異性,，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),，因此,，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。免疫熒光技術(shù)通過(guò)熒光信號(hào)的觀察來(lái)確定抗原或抗體的分布和定位,。CK7免疫

免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。CK7免疫

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,，在傳代培養(yǎng)時(shí),，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次,；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次,，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜,。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本,，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合。CK7免疫