細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基,，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,，進(jìn)行細(xì)胞固定,，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細(xì)胞通透,。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液,，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度，后續(xù)實驗可以摸索抗體的適宜濃度）,，4℃濕盒內(nèi)孵育過夜,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。COL-2免疫熒光檢查

細(xì)胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時,。col-10(COL-X)免疫熒光IF免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選。

免疫熒光通透（目的是使抗體進(jìn)入胞內(nèi)）,，0.5%TritonX-100(一種去垢劑,，用PBS配制)室溫通透20min（針對胞內(nèi)抗原，若是細(xì)胞膜上表達(dá)的抗原則省略該步驟）,；除了TritonX-100,，也可作為通透劑，并且固定后的樣品不需要通透,。封閉（減少一抗和二抗與非特異位點進(jìn)行結(jié)合）,，通透后用PBS浸洗玻片3次，每次3min,，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加山羊血清，室溫封閉30min,。常用的封閉液包括：與二抗同一來源的血清,、BSA或者是羊血清。從封閉開始所有的步驟,，一定要注意樣品的保濕,，避免樣品的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景,。醛類固定的樣品,，在用一抗孵育前用含0.3M甘氨酸的封閉液進(jìn)行封閉。

免疫熒光的原理：免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng),。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時,，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上,，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體,，直接加在抗原標(biāo)本上,，經(jīng)一定的溫度和時間的染色,，用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，室溫下干燥后封片,、鏡檢,。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合，從而實現(xiàn)可視化檢測,。

細(xì)胞的固定及免疫熒光：吸去一抗,，使用PBS浸洗 3 次，每次 5 min,。向孔內(nèi)滴加足夠量適宜濃度的二抗,，37℃，室溫避光孵育1小時,。注意二抗帶有熒光素標(biāo)記,，因此操作過程盡量在暗處進(jìn)行。吸去二抗,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。向玻片上滴加DAPI,，或者Hoechst復(fù)染細(xì)胞核,，一般為藍(lán)色熒光；避光孵育5-10min,。使用PBS輕洗細(xì)胞3 次,，每次 5 min，洗去多余的DAPI,。取爬片時由于爬片與培養(yǎng)皿底結(jié)合較緊,，張力較大，可將注射器針頭針尖向背面做個小鉤,，這樣將爬片輕輕勾起,，用小鑷子取出即可。用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，注意將爬片反過來貼于多聚賴氨酸載玻片上，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,，注意選擇抗體對應(yīng)的激發(fā)光源,。免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位。col-10(COL-X)免疫熒光IF

免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。COL-2免疫熒光檢查

熒光色素：異硫氰酸熒光素（fluoresceinisothiocyanate,，F(xiàn)ITC）為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。四乙基羅丹明（rhodamine,，RIB200）為橘紅色粉末,，不溶于水，易溶于酒精,。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm,，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光。COL-2免疫熒光檢查