熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長有關(guān),。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長,，且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí),，得到的熒光強(qiáng)度也較大。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系,。COX2免疫組化

細(xì)胞的固定及免疫熒光：1)吸除培養(yǎng)基,，一般先加入PBS浸洗細(xì)胞 3 次,，每次 5 min。2)向孔內(nèi)加入4%多聚甲醛1ml,，進(jìn)行細(xì)胞固定,，室溫固定20分鐘。3)吸去多聚甲醛,，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min。4)向孔內(nèi)加入0.5%Triton X-100(PBS配制)室溫通透20min,，目的是使細(xì)胞通透,。5) 除去Triton X-100，使用PBS浸洗 3 次,，每次 5 min,。6)用10%的與二抗同源的山羊血清(PBS配制)或者5%BSA封閉2小時(shí)（選擇的封閉液與后面操作過程中抗體稀釋液一致）。封閉后不需要用PBS清洗,。7)吸去封閉液,，向每孔滴加足夠量適宜濃度的一抗（一次使用抗體可以根據(jù)抗體說明書推薦濃度,，后續(xù)實(shí)驗(yàn)可以摸索抗體的適宜濃度），4℃濕盒內(nèi)孵育過夜,。r-H2AX免疫熒光試驗(yàn)熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測(cè)。

注意:從加熒光二抗起,后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行.DAPI復(fù)染核:爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min,。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI染液，避光室溫孵育10min,。封片：爬片置于PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動(dòng)洗滌3次,，每次5min。玻片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片,。鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像,。（DAPI紫外激發(fā)波長330-380nm，發(fā)射波長420nm,，發(fā)藍(lán)光,；FITC激發(fā)波長465-495nm，發(fā)射波長515-555nm,，發(fā)綠光,；CY3激發(fā)波長510-560，發(fā)射波長590nm,，發(fā)紅光）,。兩種抗體同時(shí)孵育：由于FIT容易萃滅，因此在孵育抗體時(shí)后孵育FITC二抗(孵育二抗一定要避光,。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記,，標(biāo)記完成后，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個(gè)定位研究,，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)提供一個(gè)明確的指導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高,、速度快的特點(diǎn)，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的,。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗結(jié)合，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識(shí)別并結(jié)合一抗,，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估。

免疫熒光間接法測(cè)抗體實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：1）熒光染色后一般在1h內(nèi)完成觀察,，或于4℃保存4h,，時(shí)間過長，會(huì)使熒光減弱,。2）每次試驗(yàn)時(shí),，需設(shè)置以下三種對(duì)照：①陽性對(duì)照：陽性血清+熒光標(biāo)記物②陰性對(duì)照：陰性血清+熒光標(biāo)記物③熒光標(biāo)記物對(duì)照：PBS+熒光標(biāo)記物3.已知抗原標(biāo)本片需在操作的各個(gè)步驟中，始終保持濕潤,，避免干燥,。4.所滴加的待檢抗體標(biāo)本或熒光標(biāo)記物，應(yīng)始終保持在已知抗原標(biāo)本片上,，避免因放置不平使液體流失,，從而造成非特異性熒光染色。免疫熒光技術(shù)利用熒光染料標(biāo)記的抗體與目標(biāo)分子結(jié)合,，從而實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè),。HIF-1a免疫抗體

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程,。COX2免疫組化

熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅,，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無法以熒光的形式發(fā)射,。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑,，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸,。在熒光抗體技術(shù)中常用一些非熒的色素物質(zhì)如亞甲藍(lán),、堿性復(fù)紅。伊文思藍(lán)或低濃度的過錳酸鉀,、碘溶液等對(duì)標(biāo)本進(jìn)行得當(dāng)復(fù)染,，以減弱非特異性熒光本質(zhì),，使特異熒光更突出顯示,。COX2免疫組化