細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題:1,、信號(hào)弱或者無(wú)信號(hào)：細(xì)胞或組織樣本保存時(shí)間過(guò)長(zhǎng),；2）抗體濃度不合適，參照抗體說(shuō)明書(shū)的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索,；3）一抗孵育時(shí)間不合適，建議 4 ℃ 過(guò)夜孵育,。2,、高背景：封閉不充分；抗體濃度過(guò)高,；抗體孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高,；清洗不充分；樣本變干,，染色過(guò)程確保樣品始終浸沒(méi)于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時(shí)間并且在封閉液中加甘氨酸,，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡和細(xì)胞存活,。組織免疫熒光檢查

免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織,。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞,，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過(guò)夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月,。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合,。ki67免疫檢測(cè)使用熒光抗體方法是免疫熒光技術(shù)中常見(jiàn)的操作步驟。

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項(xiàng)：為了保證熒光染色的正確性,，初次試驗(yàn)時(shí)需設(shè)置下述對(duì)照,，以排除某些非特異性熒光染色的干擾。①標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照：標(biāo)本加1-2滴0.01mol/L,，pH7.4的PBS,。②特異性對(duì)照（抑制試驗(yàn)）：標(biāo)本加未標(biāo)記的特異性抗體，再加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。③陽(yáng)性對(duì)照：已知的陽(yáng)性標(biāo)本加熒光標(biāo)記的特異性抗體,。如果標(biāo)本自發(fā)熒光對(duì)照和特異性對(duì)照呈無(wú)熒光或弱熒光,，陽(yáng)性對(duì)照和待檢標(biāo)本呈強(qiáng)熒光,，則為特異性陽(yáng)性染色。一般標(biāo)本在高壓汞燈下照射超過(guò)3min,，就有熒光減弱現(xiàn)象,，經(jīng)熒光染色的標(biāo)本較好在當(dāng)天觀察，隨著時(shí)間的延長(zhǎng),，熒光強(qiáng)度會(huì)逐漸下降,。

檢測(cè)復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號(hào)，并將熒光信號(hào)從背景噪聲中分離開(kāi)來(lái),。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果,。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號(hào)達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù),。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇,，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,，即熒光信號(hào)的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,，產(chǎn)生假性結(jié)果,。抗淬滅封片劑可以保護(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號(hào)完整度,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究疾病的發(fā)生機(jī)制和醫(yī)治效果評(píng)估。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時(shí)。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過(guò)夜,，一般要大于18小時(shí)或者37度,，1-2小時(shí)。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時(shí)。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí),，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間,，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí)。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過(guò)程,。CD45免疫抗體

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和信號(hào)通路。組織免疫熒光檢查

直接免疫熒光：?jiǎn)慰贵w（一抗）用于免疫染色和檢測(cè)目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合,，并使用成像顯微鏡觀察,。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無(wú)需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問(wèn)題,。與間接免疫熒光相比,，時(shí)間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過(guò)二抗進(jìn)行信號(hào)放大,；檢測(cè)靈敏度降低,；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測(cè)相比,，更昂貴,。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測(cè)目標(biāo)蛋白。首先,，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白,。然后，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識(shí)別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合,。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合,，熒光信號(hào)被放大，提供了更高的檢測(cè)靈敏度,。組織免疫熒光檢查