細胞免疫熒光實驗注意事項：非特異性染色：是否滅活內源性過氧化物酶,；孵育過程中干片；抗原熱修復過度,。染色過深：一抗?jié)舛冗^高,；染色試濃度過高或孵育時間過長；染色劑濃度過高或孵育時間過長。通常實驗室先固定細胞再進行通透,，但若檢測抗原是水不溶性蛋白,，可先通透再固定，這樣可以通過通透去除一些水溶性蛋白,，進而可降低免疫熒光背景和非特異性信號,；建議設陰性對照組，消除由于抗體非特異性結合而產生的背景染色,；選擇醛類固定液時,，保持其新鮮度，較好現配現用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會升高,。免疫熒光技術是將抗體與熒光素等示蹤物質結合，通過抗原抗體反應進行定位,。HBSAg免疫熒光試驗

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉變成熒光的百分率,，與發(fā)射熒光光量子的數值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數（熒光強度）／吸收光的光量子數（激發(fā)光強度）。發(fā)射熒光的光量子數亦即熒光強度,，除受激發(fā)光強度影響外,，也與激發(fā)光的波長有關。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,，得到的熒光強度也較大,。HBSAg免疫熒光試驗免疫熒光技術可以用于研究細胞分裂和細胞周期。

細胞免疫熒光步驟是什么呢,？步驟：1. 細胞一定要貼在玻片上（較好可以放入24孔板）,，為后面照像打基礎。細胞密度適中,，大約60-75%滿片即可,，否則容易脫片。2. 取出細胞后用4%多聚甲醛固定15分鐘,，現用現配,。（以下各步驟切毋使玻片干燥）3. PBS沖洗；4. 0.1%Triton作用20分鐘,；5. PBS沖洗,；6. 10%正常血清封閉10分鐘,；7. 加入一抗，4度孵育過夜（找個小瓶蓋將小玻片支起來,，抗體就不容易溢出）,，還要記住“砸片”，就是抗體從較高處落到片子上,，以分布均勻,。抗體稀釋度1：60,，較常用,！8. PBS沖洗4次，各5分鐘,；9加入熒光二抗,，室溫30分鐘?？贵w稀釋度1：400,，較常用！10. 90%甘油封片,。也很關鍵阿，多封幾次才有體會,。12. 避光保存,，或到顯微鏡下觀察。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準備：細胞或薄組織,。對單層生長細胞,，在傳代培養(yǎng)時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞,，取對數生長細胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片,。2.固定：取適當的固定劑固定樣本,。一般用4%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月,。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進入細胞與抗原結合,。熒光抗體法和熒光抗原法都屬于免疫熒光技術的范疇,。

免疫學的基本反應是抗原-抗體反應,。由于抗原抗體反應具有高度的特異性，所以當抗原抗體發(fā)生反應時,，只要知道其中的一個因素,，就可以查出另一個因素。免疫熒光技術就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標記在抗體（或抗原）上,，與其相應的抗原（或抗體）結合后,，在熒光顯微鏡下呈現一種特異性熒光反應。在此基礎上又分為兩種方法：直接法和間接法,。直接法：將標記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,，經過一定時間反應，即可結合并顯色,。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應結合,，再用熒光標記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應，形成抗體-抗原-抗體復合物,。免疫熒光技術中,，以熒光物質標記抗體來定位抗原物質的方法被稱為熒光抗體技術。MMP13免疫組化

熒光抗體法是利用熒光標記的抗體來追蹤或檢查相應抗原的方法,。HBSAg免疫熒光試驗

免疫熒光-實驗步驟：細胞爬片免疫熒光：在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次,每次5min;（圓蓋片：13mm24孔,；18mm12孔；20mm6孔）用4%的多聚甲醛固定爬片15min,PBS浸洗玻片3次,每次5min0.5%TritonX-100(PBS配制)室溫通透20min(細胞膜上表達的抗原省略此步驟);PBS浸洗玻片3次,每次3min,吸水紙吸干PBS,在玻片上滴加3%的BSA（PBS配置）,室溫封閉30min5,吸水紙吸掉封閉液,不洗,每張玻片滴加足夠量用PBS稀釋好的一抗并放入濕盒,4℃孵育過夜,。加熒光二抗:PBS浸洗爬片3次,每次5min,吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,濕盒中室溫孵育50min,。HBSAg免疫熒光試驗