免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20,，抗體濃度過低，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,，影響結(jié)果的觀察,。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠,。染色溫度多采用室溫（25℃左右），高于37℃可加強(qiáng)染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫,，延長染色時間。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。熒光抗體標(biāo)記使得抗原定位變得可視化,，有助于觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能。TNFa免疫組化

細(xì)胞免疫熒光實驗常見問題:1,、信號弱或者無信號：細(xì)胞或組織樣本保存時間過長,；2）抗體濃度不合適，參照抗體說明書的稀釋濃度,，再根據(jù)樣本表達(dá)量進(jìn)行摸索,；3）一抗孵育時間不合適，建議 4 ℃ 過夜孵育,。2,、高背景：封閉不充分；抗體濃度過高,；抗體孵育時間過長或溫度過高,；清洗不充分；樣本變干,，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸,，并且抗原修復(fù)也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解,，只要熒光顯微鏡的強(qiáng)度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。osteocalcin(ocn)免疫熒光試驗免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子,，并伴隨能量損失。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā),。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細(xì)胞,，可安全用于生物制劑。在進(jìn)行免疫熒光檢測時,，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理,。進(jìn)行免疫染色時，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號,。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴(kuò)增，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。

免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì),、多肽,、核酸、神經(jīng)遞質(zhì),、受體,、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原,、肉瘤標(biāo)志物,、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病,、內(nèi)分泌、藥物檢測,、免疫學(xué)、血型鑒定等,。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑,。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm,，較大發(fā)射光波長520530nm,，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì),。

免疫熒光間接法測抗體實驗步驟：滴加0.01mol/L,，pH7.4的PBS于已知抗原標(biāo)本片，10min后棄去,，使標(biāo)本片保持一定濕度,。滴加以0.01mol/L，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋的待檢抗體標(biāo)本,，覆蓋已知抗原標(biāo)本片,。將玻片置于有蓋搪瓷盒內(nèi)，37℃保溫30min,。取出玻片,，置于玻片架上，先用0.01mol/L,，pH7.4的PBS沖洗1-2次,，然后按順序過0.01mol/L，pH7.4的PBS三缸浸泡,，每缸5min,，不時振蕩。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分,，但不使標(biāo)本干燥，滴加一滴一定稀釋度的熒光標(biāo)記的抗人球蛋白抗體,。將玻片平放在有蓋搪瓷盒內(nèi),，37℃保溫30min。重復(fù)操作3,。取出玻片,，用濾紙吸去多余水分，滴加一滴緩沖甘油,，再覆以蓋玻片,。熒光顯微鏡高倍視野下觀察，結(jié)果判定同直接法,。免疫熒光技術(shù)是基于免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的重要方法之一。osteocalcin(ocn)免疫熒光試驗

免疫熒光技術(shù)可以用于研究環(huán)境污染和毒物作用,。TNFa免疫組化

熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,，較大吸收光波長為490--495nm,，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低。TNFa免疫組化