細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：非特異性染色：是否滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶,；孵育過(guò)程中干片；抗原熱修復(fù)過(guò)度,。染色過(guò)深：一抗?jié)舛冗^(guò)高,；染色試濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)；染色劑濃度過(guò)高或孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng),。通常實(shí)驗(yàn)室先固定細(xì)胞再進(jìn)行通透,，但若檢測(cè)抗原是水不溶性蛋白，可先通透再固定,，這樣可以通過(guò)通透去除一些水溶性蛋白,，進(jìn)而可降低免疫熒光背景和非特異性信號(hào)；建議設(shè)陰性對(duì)照組,，消除由于抗體非特異性結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色,；選擇醛類固定液時(shí)，保持其新鮮度,，較好現(xiàn)配現(xiàn)用,，使用不新鮮的醛類固定液自發(fā)熒光背景會(huì)升高。免疫熒光技術(shù)可以用于研究病毒傳播和免疫應(yīng)答,。CK19免疫

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長(zhǎng)（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過(guò)短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長(zhǎng)發(fā)射光子，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過(guò)顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過(guò)可見(jiàn)光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場(chǎng)上購(gòu)買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長(zhǎng)范圍,。它們不會(huì)損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑,。在進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)時(shí),，首先對(duì)細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時(shí),，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號(hào)。根據(jù)使用的抗體和所需的信號(hào)擴(kuò)增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。CK19免疫免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用，可以用于檢測(cè)病原體,、肉瘤標(biāo)志物等,。

通過(guò)不同顏色熒光標(biāo)記不同的靶標(biāo)，可以直觀的觀察同一樣品細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)和蛋白。熒光標(biāo)記靶標(biāo)的方法主要包括熒光染料,、免疫標(biāo)記,、熒光融合蛋白等——這幾種方法均可選擇性標(biāo)記細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)和蛋白,，讓您在成像時(shí)更輕松地進(jìn)行觀察,。細(xì)胞生物學(xué)采用的很多熒光工具基本上都是熒光基團(tuán)。這些熒光基團(tuán)經(jīng)過(guò)不同的方法修飾或結(jié)合到不同的分子上,，從而具備了某些的功能與特定的細(xì)胞器或蛋白結(jié)合,。通過(guò)化學(xué)修飾，單個(gè)熒光基團(tuán)可以產(chǎn)生許多變體形式,，且每種變體都有不同的特異性,。

免疫熒光通過(guò)抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原-抗體結(jié)合反應(yīng),，進(jìn)而對(duì)抗原所在的細(xì)胞或組織進(jìn)行定性或定量,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光,，可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織,，利用定量技術(shù)測(cè)定含量，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定性和定位分析,。細(xì)胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測(cè)蛋白的細(xì)胞定位,。材料與儀器：樣品：貼壁細(xì)胞；試劑：4% 組織固定液,，PBS,，Triton X-100，BSA,，熒光二抗,，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液,，0.25% 胰酶,；器材：6/12/24 孔板，細(xì)胞爬片（蓋玻片）,，載玻片,，15 ml 離心管。免疫熒光技術(shù)可以用于研究?jī)?nèi)臟移植和免疫抑制,。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透,。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透,；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果,；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光,?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間,，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察,，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周,。無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h,；一抗是否適用固定液和石蠟切片,，使用濃度是否過(guò)低，孵育是否時(shí)間過(guò)短等,。免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用,，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。CK14免疫組化IHC

免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用,。CK19免疫

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí),。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘。3. PBS洗凈：3min×3,。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS。5. PBS洗凈：2×5 min,。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘。7. 一抗,，4度過(guò)夜,，一般要大于18小時(shí)或者37度，1-2小時(shí),。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次。9. 二抗37度小于一小時(shí),。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí)，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次,，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí)。CK19免疫