熒光物質(zhì),，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素,。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱(chēng)為免疫熒光色素或熒光染料,。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,，較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光,，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu),，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性,、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好,，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素,。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感,，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末,，不溶于水,，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定,，可長(zhǎng)期保存,。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm,，呈橘紅色熒光,。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm,，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫相關(guān)疾病和自身免疫病,。COX2免疫抗體

免疫熒光固定（防止離體組織自溶抗原擴(kuò)散）,，固定液包括：有機(jī)溶劑（甲醇、乙醇等）,；交聯(lián)劑（4%PFA,、10%中性福爾馬林），固定液的選擇取決于被研究抗原的性質(zhì)及所用抗體的特性,，不過(guò),，目前甲醛用的還是較多的，但針對(duì)磷酸化的抗體，不適合用甲醛,，會(huì)導(dǎo)致磷酸蛋白從膜表面轉(zhuǎn)移到胞漿中,，故應(yīng)選擇冰冷的無(wú)水甲醇或無(wú)水乙醇，同時(shí)應(yīng)注意甲醛會(huì)揮發(fā),，在4-8°C不宜儲(chǔ)存太久,。固定時(shí)間：取決于組合塊的大小和類(lèi)型，對(duì)于大多數(shù)組織,，18-24h較為理想,，細(xì)胞固定時(shí)間較短，一般2%的甲醛室溫固定20min即可,。以細(xì)胞樣品為例：用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次,，每次3min,。CK7免疫熒光檢查免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。

免疫熒光檢測(cè)相對(duì)于酶檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)：定量熒光信號(hào)的能力（與使用基于酶的方法進(jìn)行的定性測(cè)定相反）,；復(fù)用能力（可以結(jié)合不同發(fā)射光譜的熒光染料來(lái)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)）,；熒光染料的光穩(wěn)定性。免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理,，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,，制成熒光抗體，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）,。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見(jiàn)熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量,。

其他熒光物質(zhì)：1．酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無(wú)熒光效應(yīng)，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強(qiáng)熒光的物質(zhì),。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮,，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長(zhǎng)為360nm,，發(fā)射光波長(zhǎng)為450nm,。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過(guò)氧化物酶的底物對(duì)羥基乙酸等。2．鑭系螯合物某些3價(jià)稀土鑭系元素如銪（Eu3+）,、鋱（Tb3+）,、鈰（Ce3+）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3+應(yīng)用較廣,。Eu3+螯合物的激發(fā)光波長(zhǎng)范圍寬,，發(fā)射光波長(zhǎng)范圍窄,，熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，較適合用于分辨熒光免疫測(cè)定,。所需要的儀器：熒光顯微鏡,、顯微熒光分光光度計(jì)、流式細(xì)胞儀和時(shí)間分辨熒光計(jì)等儀器激光共聚焦顯微鏡,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用,。

zo-1的免疫熒光，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí),，從孵箱中取出,。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘,。4.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次，每次10分鐘,。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋?zhuān)┓旁跐窈欣铮?度過(guò)夜。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘，閉光,。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。12.95%甘油封片,。注：4%甲醛,，0.2%Triton，5%BSA均用1×PBS稀釋,。免疫熒光在醫(yī)學(xué)診斷中起著重要作用,，可以用于檢測(cè)病原體、肉瘤標(biāo)志物等,。col-10(COL-X)免疫熒光試驗(yàn)

免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),。COX2免疫抗體

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究,，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,，標(biāo)記目的靶點(diǎn),。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無(wú)關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。COX2免疫抗體