免疫熒光法是將免疫學(xué)方法(抗原抗體特異結(jié)合)與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法,。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，從而可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞(或組織)化學(xué)技術(shù),。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物,，再用這種熒光抗體(或抗原)作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原(或抗體),。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光(黃綠色或桔紅色),，可以看見熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì),、定位,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究免疫系統(tǒng)的功能和異常。VWF免疫組化

zo-1的免疫熒光,，步驟如下：1.細(xì)胞在蓋片上生長(zhǎng)融合到95%-100%時(shí),，從孵箱中取出。2.用預(yù)溫的1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。3.4%的甲醛室溫固定20-30分鐘。4.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。5.0.2%TritonX-100透化2-5分鐘,。6.1×PBS洗3次,，每次10分鐘。7.5%BSA室溫封閉30分鐘,。8.加一抗（用1%BSA稀釋）放在濕盒里,，4度過夜。9.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。10.加二抗(用1%BSA稀釋)30分鐘,，閉光。11.1×PBS洗3次,，每次10分鐘,。12.95%甘油封片。注：4%甲醛,，0.2%Triton,，5%BSA均用1×PBS稀釋。r-H2AX免疫組化IHC使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù),。

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實(shí)現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應(yīng)建立針對(duì)目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時(shí)將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,，標(biāo)記目的靶點(diǎn),。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。

細(xì)胞免疫熒光簡(jiǎn)單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時(shí)。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時(shí)或者37度,，1-2小時(shí)。8. 4度PBS洗凈，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時(shí),。10. 37度 PBS洗凈，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí),，都要漂洗干凈并且要測(cè)下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長(zhǎng)PBS清洗時(shí)間,，如果結(jié)果背景較高可以延長(zhǎng)漂洗的次數(shù)和時(shí),。免疫熒光技術(shù)可以用于研究肉瘤的發(fā)生和發(fā)展過程。

熒光色素：四甲基異硫氰酸羅丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate,，TRITC）結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm,，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光,。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合,，但熒光效率較低,。免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種,。它是在免疫學(xué),、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位,。免疫熒光是一種常用的生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，用于檢測(cè)和定位特定抗原或抗體,。VWF免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以用于研究植物病理學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn),。VWF免疫組化

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì),，會(huì)產(chǎn)生背景熒光,，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì),。因此在孵育一抗前,，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察，確?？乖旧頉]有信號(hào),。2、陽性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞,，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理,，結(jié)果應(yīng)為陽性，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過程中用的試劑及方法均可靠,。3,、陰性對(duì)照：與陽性對(duì)照相反，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色,，結(jié)果若為陰性,，可排除染色過程中由于非特異性染色造成的假陽性結(jié)果。VWF免疫組化