熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液,，置入三角燒瓶中,，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量,，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中,。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞凋亡,、細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化等生物學(xué)過程。INOS免疫熒光染色

免疫熒光實(shí)驗(yàn)的注意事項：對熒光標(biāo)記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋度不應(yīng)超過1：20，抗體濃度過低,，會導(dǎo)致產(chǎn)生的熒光過弱,，影響結(jié)果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標(biāo)本及抗原而變化,，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右）,，高于37℃可加強(qiáng)染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間,。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。CTNT免疫熒光染色熒光抗體法是利用熒光標(biāo)記的抗體來追蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法,。

細(xì)胞免疫熒光主要用于蛋白定位研究和細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，細(xì)胞免疫熒光技術(shù)是利用免疫技術(shù)和熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合,，原理就是利用抗原-抗體反應(yīng)之后,，采用熒光標(biāo)記，標(biāo)記完成后,，顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)某種抗原成分的多少,，從而做出一個定位研究，也可以為細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)提供一個明確的指導(dǎo),，細(xì)胞免疫熒光具有敏感性強(qiáng),、特異性高、速度快的特點(diǎn),，是目前比較常用的組織學(xué)技術(shù),，也是比較精確的。免疫熒光染色的主要原理是利用抗原抗體之間的特異性結(jié)合來顯示目的蛋白,，主要包括蛋白和一抗結(jié)合,，其次是帶有熒光基團(tuán)的二抗識別并結(jié)合一抗，熒光顯微鏡下即可觀察到熒光,。

免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團(tuán)在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團(tuán)可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細(xì)胞，可安全用于生物制劑,。在進(jìn)行免疫熒光檢測時,，首先對細(xì)胞或組織進(jìn)行固定和透化處理。進(jìn)行免疫染色時,，熒光團(tuán)與目標(biāo)抗原的抗體結(jié)合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴(kuò)增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型,。免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位,。

直接免疫熒光：單抗體（一抗）用于免疫染色和檢測目標(biāo)蛋白,。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性,，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題,。與間接免疫熒光相比，時間縮短（操作步驟減少）,。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過二抗進(jìn)行信號放大,；檢測靈敏度降低；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限,；與使用熒光二抗的檢測相比,，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測目標(biāo)蛋白,。首先，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白,。然后,，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個以上的二抗可以與一抗結(jié)合,，熒光信號被放大,，提供了更高的檢測靈敏度。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動物模型和藥物篩選,。CD19免疫熒光檢查

免疫熒光技術(shù)可以通過熒光顯微鏡觀察樣品中的熒光信號,，從而確定目標(biāo)分子的存在和位置。INOS免疫熒光染色

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項：1,、建議細(xì)胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細(xì)胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結(jié)果,；2,、若實(shí)驗(yàn)室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細(xì)胞植于細(xì)胞爬片,。建議直接購買處理過的細(xì)胞爬片,；若只有普通細(xì)胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強(qiáng),，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜,，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液,，若用 75% 乙醇浸泡,，則不需要此步驟。然后,，用洗潔精搓洗爬片,，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用,。INOS免疫熒光染色