熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中,，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后,，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時添冰去水,；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中。免疫熒光技術(shù)具有高靈敏度和高特異性,，可以檢測非常低濃度的目標(biāo)分子,。IL-10免疫熒光分析

檢測復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來,。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果,。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號達(dá)到峰值特異性,、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇,，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,，即熒光信號的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,，產(chǎn)生假性結(jié)果,。抗淬滅封片劑可以保護(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性,，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度,。Tyrosine Hydroxylase(TH)免疫熒光試驗熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實現(xiàn)精確的免疫檢測,。

細(xì)胞和組織樣品處理：準(zhǔn)備熒光標(biāo)記的細(xì)胞樣品：為實現(xiàn)較佳的圖像質(zhì)量,，首先應(yīng)建立針對目的蛋白和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的研究，同時將其他一切背景等排除在圖像之外,。固定和破膜細(xì)胞樣品用于標(biāo)記–首先將細(xì)胞結(jié)構(gòu),、蛋白和核酸固定，然后使熒光染料和抗體滲入到細(xì)胞內(nèi)部,，標(biāo)記目的靶點,。封閉細(xì)胞樣品，防止熒光標(biāo)記物與研究無關(guān)的蛋白非特異性結(jié)合,，較大限度提高信噪比,。蛋白封閉液有助于減少非特異染色?？贵w能夠取代封閉蛋白與其表位形成高親和力結(jié)合,，而封閉液可防止樣品中的低親和力結(jié)合。

免疫熒光Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記而獲得成功,。這種以熒光物質(zhì)標(biāo)記抗體而進(jìn)行抗原定位的技術(shù)稱為熒光抗體技術(shù),。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法,。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù),，因為熒光色素不但能與抗體球蛋白結(jié)合，用于檢測或定位各種抗原,，也可以與其他蛋白質(zhì)結(jié)合,，用于檢測或定位抗體，但是在實際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用,，所以人們習(xí)慣稱為熒光抗體技術(shù),，或稱為免疫熒光技術(shù)。以熒光抗體方法較常用,。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù),。免疫熒光技術(shù)是將抗體與熒光素等示蹤物質(zhì)結(jié)合,，通過抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行定位。

免疫熒光實驗步驟：1.樣本準(zhǔn)備：細(xì)胞或薄組織,。對單層生長細(xì)胞,，在傳代培養(yǎng)時，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細(xì)胞接近長成單層后取出蓋玻片,，PBS洗兩次；對懸浮生長細(xì)胞,，取對數(shù)生長細(xì)胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,。2.固定：取適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭颖?。一般?%PFA固定4℃過夜。固定完畢后的樣本可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月,。3.洗滌：PBS洗滌5min*3次,。4.打孔：選擇合適的通透劑處理樣本，目的是使抗體更容易進(jìn)入細(xì)胞與抗原結(jié)合,。使用已知熒光抗原標(biāo)記物質(zhì)來檢查相應(yīng)抗體的方法被稱為熒光抗原技術(shù),。IL-10免疫熒光分析

免疫熒光技術(shù)可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。IL-10免疫熒光分析

熒光效率：熒光分子不會將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,，總或多或少地以其他形式釋放,。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比,。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）,。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,，也與激發(fā)光的波長有關(guān),。各個熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜）,，即在某一特定波長處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰,。選擇激發(fā)光波長量接近于熒光分子的較大吸收峰波長，且測定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時,，得到的熒光強(qiáng)度也較大,。IL-10免疫熒光分析