免疫熒光的原理和類型：免疫熒光利用熒光分子或熒光團在一定波長（分子的吸收光譜）下吸收光子的特性,，經(jīng)過短暫的間隔（發(fā)射光譜）后以較高的波長發(fā)射光子，并伴隨能量損失,。發(fā)射的熒光可通過顯微鏡觀察到,。熒光團可以通過可見光或紫外光激發(fā)。具有高光穩(wěn)定性和熒光量子產(chǎn)率的熒光染料可在市場上購買,，其激發(fā)較大值跨越從400到>700nm的波長范圍,。它們不會損傷活細胞，可安全用于生物制劑,。在進行免疫熒光檢測時,，首先對細胞或組織進行固定和透化處理。進行免疫染色時,，熒光團與目標抗原的抗體結合,，然后使用成像顯微鏡觀察熒光信號。根據(jù)使用的抗體和所需的信號擴增,，免疫熒光可分為直接和間接兩種類型。使用已知熒光抗原標記物質(zhì)來檢查相應抗體的方法被稱為熒光抗原技術,。CD31免疫組化

免疫熒光技術的主要特點是：特異性強,、敏感性高、速度快,。主要缺點是：非特異性染色問題尚未完全解決,，結果判定的客觀性不足,，技術程序也還比較復雜。熒光免疫法按反應體系及定量方法不同,，還可進一步分做若干種,。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染,，并且大多操作簡便,，便于推廣。國外生產(chǎn)的TDM用試劑盒,，有相當一部分即屬于此類,，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測定中的本底較高等問題,，熒光免疫技術用于定量測定有一定困難,。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測定，與酶免疫測定和放射免疫分析一樣,，在臨床檢驗中應用,。Tyrosine Hydroxylase(TH)免疫熒光染色免疫熒光技術可以用于研究內(nèi)臟移植和免疫抑制。

細胞免疫熒光簡單實驗步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7,、4 37度 PBS 2小時。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然,、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘,。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時或者37度,，1-2小時。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min,。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時,，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時間,，如果結果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時,。

細胞免疫熒光實驗注意事項：1、建議細胞直接種孔板,，采用倒置熒光顯微鏡拍照,，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結果；2,、若實驗室只有正置熒光顯微鏡,，則需要將細胞植于細胞爬片。建議直接購買處理過的細胞爬片,；若只有普通細胞爬片,，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜,，若用酸浸泡過夜,，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡,，則不需要此步驟,。然后，用洗潔精搓洗爬片,，然后用去離子水清洗爬片,。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用,。熒光抗體技術可用于檢測和定位各種抗原,，也可以用于檢測和定位抗體。

免疫熒光實驗的注意事項：對熒光標記的抗體的稀釋,，要保證抗體的蛋白有一定的濃度,，一般稀釋度不應超過1：20，抗體濃度過低,，會導致產(chǎn)生的熒光過弱,，影響結果的觀察。染色的溫度和時間需要根據(jù)各種不同的標本及抗原而變化,，染色時間可以從10min到數(shù)小時,，一般30min已足夠。染色溫度多采用室溫（25℃左右）,，高于37℃可加強染色效果,，但對不耐熱的抗原（如流行性乙型腦炎病毒）可采用0-2℃的低溫，延長染色時間,。低溫染色過夜較37℃30min效果好的多,。免疫熒光技術可以用于研究免疫相關疾病和自身免疫病。Tyrosine Hydroxylase(TH)免疫熒光染色

免疫熒光技術利用熒光染料標記的抗體與目標分子結合,，從而實現(xiàn)可視化檢測,。CD31免疫組化

細胞免疫熒光實驗常見問題:1、信號弱或者無信號：細胞或組織樣本保存時間過長,；2）抗體濃度不合適,，參照抗體說明書的稀釋濃度，再根據(jù)樣本表達量進行摸索,；3）一抗孵育時間不合適,，建議 4 ℃ 過夜孵育。2,、高背景：封閉不充分,；抗體濃度過高；抗體孵育時間過長或溫度過高,；清洗不充分,；樣本變干，染色過程確保樣品始終浸沒于液體環(huán)境中.3,、非特異性染色較多：固定液殘留,，這里需要縮短固定時間并且在封閉液中加甘氨酸，并且抗原修復也可以幫助解決非特異性染色,；二抗殘留,，二抗需要用帶有吐溫 20 的 PBS 溶解，只要熒光顯微鏡的強度還可以增大,，那么就可以增加吐溫洗脫掉非特異性染色,。CD31免疫組化