免疫熒光應(yīng)用范圍：其應(yīng)用范圍極其普遍,，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì),、細(xì)胞因子、細(xì)胞表面抗原,、多肽,、核酸、受體,、神經(jīng)遞質(zhì),、肉瘤標(biāo)志物,、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì),。根據(jù)診斷類別,，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌,、藥物檢測,、免疫學(xué),、血型鑒定等。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：洗滌：PBS洗滌5min*3次。封閉：使用封閉液對樣本進(jìn)行封閉,，一般1h。加一抗：使用合適濃度的一抗與樣本4℃過夜,。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。加二抗：使用間接法時(shí)需要加二抗處理,，根據(jù)說明書使用合適的濃度,，避光處理1h（后面步驟均需避光）。洗滌：PBS或PBST洗滌5min*3次,。封片：滴一滴防淬滅劑,，封片?？闪⒓从^察后暫存4℃盡快觀察。免疫熒光技術(shù)可以用于研究動(dòng)物模型和藥物篩選,。CD86免疫熒光檢查

細(xì)胞免疫熒光簡單實(shí)驗(yàn)步驟如下：1. 漂洗血清蛋白H7,、2-7、4 37度 PBS 2小時(shí),。2. -20度甲醇固定20分鐘后,自然、干燥 10分鐘,。3. PBS洗凈：3min×3。4. 1%Triton：25 min~30 min,、配成50 ultriton+5 mlpBS,。5. PBS洗凈：2×5 min。6. 羊血清封閉：37度,，20分鐘。7. 一抗，4度過夜,，一般要大于18小時(shí)或者37度,，1-2小時(shí),。8. 4度PBS洗凈,，3 min×5次,。9. 二抗37度小于一小時(shí)。10. 37度 PBS洗凈,，3×5 min。11. 涼干封片（封閉液PH8.5）,；不管采用何種方法,，在使用PBS緩沖液漂洗時(shí),，都要漂洗干凈并且要測下pH值,，可以使用PBS多清洗幾次，也可以延長PBS清洗時(shí)間,，如果結(jié)果背景較高可以延長漂洗的次數(shù)和時(shí),。E-cad免疫熒光試驗(yàn)免疫熒光技術(shù)通過熒光信號的觀察來確定抗原或抗體的分布和定位,。

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液,，使然后蛋白濃度為20mg/ml,，緩沖液容量為總量的1/10,，混勻,，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min,。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素,，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末,。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中,，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完）,，加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h,。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右,，故須及時(shí)添冰去水,；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫中,。

檢測復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號，并將熒光信號從背景噪聲中分離開來,。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果,。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號達(dá)到峰值特異性,、高清晰度和較佳放大倍數(shù),。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白,，即熒光信號的光化學(xué)降解或衰退,。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差,，產(chǎn)生假性結(jié)果?？勾銣绶馄瑒┛梢员Ｗo(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號完整度,。熒光抗體技術(shù)具有高靈敏度和高特異性，可以實(shí)現(xiàn)精確的免疫檢測,。

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,，所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),，只要知道其中的一個(gè)因素，就可以查出另一個(gè)因素,。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體（或抗原）上，與其相應(yīng)的抗原（或抗體）結(jié)合后,，在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。在此基礎(chǔ)上又分為兩種方法：直接法和間接法,。直接法：將標(biāo)記的特異性熒光抗體直接加到抗原上,，經(jīng)過一定時(shí)間反應(yīng)，即可結(jié)合并顯色,。間接法：先用抗原的抗體（一抗）與抗原反應(yīng)結(jié)合，再用熒光標(biāo)記的二抗（一抗的抗體）與抗原反應(yīng),，形成抗體-抗原-抗體復(fù)合物,。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合,，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì),。GLUT4免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以通過熒光信號顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。CD86免疫熒光檢查

熒光抗體技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后,，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法,。免疫熒光測定：抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法,。免疫熒光實(shí)驗(yàn)步驟：直接法測抗原：基本原理：將熒光素標(biāo)記在相應(yīng)的抗體上,，直接與相應(yīng)抗原反應(yīng),。其優(yōu)點(diǎn)是方法簡便、特異性高,，非特異性熒光染色少,。缺點(diǎn)是敏感性偏低,；而且每檢查一種抗原就需要制備一種熒光抗體。此法常用于細(xì)菌,、病毒等微生物的快速檢查和腎炎活檢,、皮膚活檢的免疫病理檢查。CD86免疫熒光檢查