異硫氰酸熒光素(FITC)是一種有機(jī)熒光染料,，目前，這種熒光染料仍用于免疫熒光和流式細(xì)胞術(shù)中,。在495/517nm處,，該染料會產(chǎn)生激發(fā)/發(fā)射峰值，并可借助異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán)與不同抗體結(jié)合,，該基團(tuán)可以和蛋白質(zhì)上的氨基,、巰基、咪唑,、酪氨酰,、羰基等基團(tuán)相結(jié)合。而它的基本成分——熒光素,，其摩爾質(zhì)量為332g/mol,，常被用作熒光示蹤劑。FITC(389g/mol)是用于熒光顯微鏡技術(shù)的首批染料,，且其被當(dāng)成AlexaFluor®488等后續(xù)熒光染料的發(fā)端。該染料的熒光活性取決于它的大共軛芳香電子系統(tǒng),，而該系統(tǒng)受藍(lán)色光譜中的光所激發(fā),。經(jīng)常與FITC同時使用的另一種染料是與其相似的TRITC[四甲基羅丹明-5(6)-異硫氰酸]。與FITC相反,，TRITC并非熒光素,，而是羅丹明家族的衍生物。羅丹明也具有一個大的共軛芳香電子系統(tǒng),，正是該系統(tǒng)引發(fā)了它們的熒光行為,。還有一點(diǎn)與FITC相反，TRITC(479g/mol)由比較**長為550nm的綠色光譜中的光所激發(fā),，它的比較大發(fā)射波長為573nm,。與蛋白質(zhì)（例如，抗體）結(jié)合也基于異硫氰酸鹽反應(yīng)基團(tuán),。DAPI染色液（DAPI Staining Solution）常用于細(xì)胞核染色,，可將細(xì)胞核染成藍(lán)色。中國臺灣熒光染料luc

有機(jī)熒光染料近紅外有機(jī)熒光染料：優(yōu)勢：發(fā)射波長在近紅外區(qū)域的熒光染料,，如近紅外二區(qū)熒光染料（NIR-Ⅱ,，1000～1700nm）,，由于其發(fā)射波長較長，光散射和組織自發(fā)熒光干擾較少,，在生物組織成像中具有更高的時空分辨率和更深的成像深度13,。例如，WenShi和其同事在中國科學(xué)院開發(fā)的一系列基于呫噸的染料（VIXs）,，其中VIX-4在波長超過1200nm處發(fā)出熒光,，被用于小鼠的血液循環(huán)成像。研究人員將VIX-4封裝在脂質(zhì)體中,，注射到小鼠的尾靜脈,，展示了該染料在生物成像中的良好性能12。應(yīng)用場景：適用于需要深度成像和高分辨率的生物醫(yī)學(xué)研究,，如**檢測,、血管成像等。具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）特性的有機(jī)熒光染料：優(yōu)勢：相對傳統(tǒng)的因聚集導(dǎo)致熒光猝滅（ACQ）的染料,，AIE染料在生物成像和診斷中受到越來越多的關(guān)注,。例如，將具有AIE特性的染料BPMT和具有ACQ特性的染料硼二吡咯亞甲基（BODIPY）分別制成納米粒子（ANPs和BNPs）進(jìn)行對比研究,。結(jié)果表明,，**負(fù)載BODIPY的BNPs（BNP1）能有效聚集在**組織中，實現(xiàn)長期無創(chuàng)成像,，而高負(fù)載BPMT的ANP4生物成像能力較差,。這說明通過巧妙運(yùn)用納米技術(shù)，可將ACQ效應(yīng)的弱點(diǎn)轉(zhuǎn)化為優(yōu)勢,，實現(xiàn)高效的靶向**成像16,。西安熒光染料Cy5.5Super Flour 系列熒光探針，具有更強(qiáng)的熒光強(qiáng)度,，更廣的pH應(yīng)用范圍（pH 4～10）, 更好的抗淬滅性,。

影響熒光染料性能的因素分子結(jié)構(gòu)：熒光染料的分子結(jié)構(gòu)對其熒光性能有著重要的影響。例如,，共軛體系的大小,、發(fā)色團(tuán)和助色團(tuán)的種類和位置等都會影響熒光染料的吸收和發(fā)射波長、熒光強(qiáng)度等性能345,。環(huán)境因素：溶劑效應(yīng)：溶劑的極性,、pH值等會影響熒光染料的熒光性能。一般來說,，溶劑的極性越大,，熒光染料的發(fā)射波長會發(fā)生紅移；而pH值的變化則可能會影響熒光染料的分子結(jié)構(gòu),，從而改變其熒光性能37,。溫度：溫度的變化會影響熒光染料分子的熱運(yùn)動和激發(fā)態(tài)的壽命,，從而影響熒光強(qiáng)度。一般來說,，溫度升高,，熒光強(qiáng)度會降低25。濃度：當(dāng)熒光染料的濃度較高時,，可能會發(fā)生自聚集現(xiàn)象,，導(dǎo)致熒光淬滅。因此,，在使用熒光染料時,，需要控制其濃度，以避免自聚集的發(fā)生34,?？傊瑹晒馊玖系淖饔迷硎腔谄浞肿咏Y(jié)構(gòu)的特點(diǎn),，通過吸收激發(fā)光,，使電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，然后再通過輻射躍遷回到基態(tài),，發(fā)射出熒光,。其性能受到分子結(jié)構(gòu)和環(huán)境因素的影響。了解熒光染料的作用原理,，對于其在各個領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要的意義,。

DiD，DiO,，DiI,，DiR和DiS染料是一族親脂性的熒光染料，可以用來染細(xì)胞膜和其它脂溶性生物結(jié)構(gòu),。當(dāng)與細(xì)胞膜結(jié)合后其熒光強(qiáng)度**增強(qiáng)，這類染料有著很高的淬滅常數(shù)和激發(fā)態(tài)壽命,。一旦對細(xì)胞染色,，這類染料在整個細(xì)胞膜上擴(kuò)散，比較好濃度時可以使整個細(xì)胞膜染色,。它們的熒光顏**分明顯：DiI（橙色熒光）,，DiO（綠色熒光），DiD（紅色熒光）和 DiR （深紅色熒光）這使得他們可以用來對活細(xì)胞進(jìn)行多色成像和流式分析,。DiI和DiO可以分別用標(biāo)準(zhǔn)的 FITC和TRITC的濾光片,。DiD可以用 633 nm He–Ne 激光器激發(fā)，有著比DiI更長的激發(fā)波長和發(fā)射波長,，在細(xì)胞和組織染色中更有價值,。 DiR的紅外熒光可以穿透細(xì)胞和組織,，在***成像中用來示蹤。Super Fluor 488（效果同Alexa Fluor 488）標(biāo)記蛋白,。

三,、流式細(xì)胞儀分析1、取對數(shù)生長期的細(xì)胞,，接種到孔板,，過夜培養(yǎng)。2,、如果要進(jìn)行藥物刺激,，在細(xì)胞中加入感興趣的藥物進(jìn)行干預(yù)，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間后,，收集細(xì)胞,，PBS清洗2次。3,、加入Rhodamine123工作液重懸細(xì)胞,，37℃避光孵育15min或更長時間?！咀⒁狻浚河捎诩?xì)胞種類和實驗體系不同,，Rhodamine123工作液濃度和孵育時間可以根據(jù)預(yù)實驗或參考文獻(xiàn)自行調(diào)整。4,、用流式細(xì)胞儀檢測,。

四、實驗案例1,、取對數(shù)生長期A549細(xì)胞接于六孔板（1*106+2mlDMEM培養(yǎng)基）,37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4-24h待其貼壁,，以便后續(xù)實驗操作.2、棄掉培養(yǎng)液,，PBS洗滌兩次.3,、用培養(yǎng)基（無血清）稀釋Rh123母液制備1～20μMRh123工作液。具體工作濃度取決于細(xì)胞類型和細(xì)胞濃度,。4,、將Rh123工作液加入六孔板并在37℃下孵育30分鐘.5、去除Rh123工作液并用PBS洗滌三次細(xì)胞去除背景色.6,、熒光顯微鏡觀察. Cy3 (Cyanine 3) 是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素?zé)晒馊玖?。熒光染料發(fā)射

熒光染料，由于靈敏度高,，操作方便,，逐漸取代了放射性同位素作為檢測標(biāo)記，其應(yīng)用于熒光探針，細(xì)胞染色等,。中國臺灣熒光染料luc

生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域在細(xì)胞熒光成像中,，近紅外氧雜蒽熒光染料可用于細(xì)胞熒光染色成像，如熒光染料NXD-3具有良好的細(xì)胞線粒體靶向熒光標(biāo)記效果5,。通過特定的熒光染料可以對細(xì)胞內(nèi)的特定結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)記,，有助于研究人員觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和功能。高分辨率熔解分析（HRM）中,，不同的DNA結(jié)合熒光染料可用于PCR擴(kuò)增和熔解曲線分析等,。例如，SYTO16和SYTO13在多數(shù)檢測中性能與商業(yè)HRM染料相當(dāng),，適用于實時PCR和HRM應(yīng)用1418,。二、化學(xué)領(lǐng)域為考察小分子配基與不同核酸結(jié)構(gòu)的結(jié)合機(jī)理,，發(fā)展新的核酸探針分子,，合成了一種新型一次甲基不對稱菁染料（MTP）。MTP可作為熒光探針分子用于區(qū)別不同結(jié)構(gòu)的核酸分子,，其與平行和混合平行G-四鏈體DNA結(jié)合較強(qiáng),，與單/雙鏈DNA作用較弱，與反平行G-四鏈體DNA作用**弱11,。新型BODIPY類熒光染料可用于檢測大氣污染物苯硫酚和硒代半胱氨酸,，還可以實現(xiàn)對細(xì)胞內(nèi)的苯硫酚進(jìn)行檢測，具有重要的生物應(yīng)用前景,。中國臺灣熒光染料luc