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高效液相色譜的歷史
1903年俄國(guó)植物化學(xué)家茨維特(Tswett)***提出“色譜法”(Chromatography)和“色譜圖”(Chromatogram)的概念。茨維特使用色譜法 chromatography 來(lái)描述他的彩色試驗(yàn),。
1930年以后,,相繼出現(xiàn)了紙色譜、離子交換色譜和薄層色譜等液相色譜技術(shù),。
1952年,,英國(guó)學(xué)者M(jìn)artin和Synge 基于他們?cè)诜峙渖V方面的研究工作,提出了關(guān)于氣-液分配色譜的比較完整的理論和方法,,把色譜技術(shù)向前推進(jìn)了一大步,,這是氣相色譜在此后的十多年間發(fā)展十分迅速的原因。
1958年,,基于Moore和Stein的工作,,離子交換色譜的儀器化導(dǎo)致了氨基酸分析儀的出現(xiàn),這是近代液相色譜的一個(gè)重要嘗試,,但分離效率尚不理想,。
1960年中后期,氣相色譜理論和實(shí)踐發(fā)展,,以及機(jī)械,、光學(xué)、電子等技術(shù)上的進(jìn)步,,液相色譜又開(kāi)始活躍,。到60年代末期把高壓泵和化學(xué)鍵合固定相用于液相色譜就出現(xiàn)了HPLC,。
1970年中期以后,微處理機(jī)技術(shù)用于液相色譜,,進(jìn)一步提高了儀器的自動(dòng)化水平和分析精度,。
1990年以后,生物工程和生命科學(xué)在國(guó)際和國(guó)內(nèi)的迅速發(fā)展,,為高效液相色譜技術(shù)提出了更多,、更新的分離、純化,、制備的課題,,如人類(lèi)基因組計(jì)劃,蛋白質(zhì)組學(xué)有HPLC作預(yù)分離等,。
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什么是液相色譜,?
液相色譜是一類(lèi)分離與分析技術(shù),其特點(diǎn)是以液體作為流動(dòng)相,,固定相可以有多種形式,,如紙、薄板和填充床等,。在色譜技術(shù)發(fā)展的過(guò)程中.為了區(qū)分各種方法,,根據(jù)固定相的形式產(chǎn)生了各自的命名,如紙色譜,、薄層色譜和柱液相色譜,。
經(jīng)典液相色譜的流動(dòng)相是依靠重力緩慢地流過(guò)色譜柱,,因此固定相的粒度不可能太小(100μm~150μm左右)。分離后的樣品是被分級(jí)收集后再進(jìn)行分析的,,使得經(jīng)典液相色譜不僅分離效率低,、分析速度慢,,而且操作也比較復(fù)雜,。直到20世紀(jì)60年代.發(fā)展出粒度小于10μm的高效固定相,并使用了高壓輸液泵和自動(dòng)記錄的檢測(cè)器,,克服了經(jīng)典液相色譜的缺點(diǎn),,發(fā)展成高效液相色譜,也稱(chēng)為高壓液相色譜,。
高效液相色譜綜述
HPLC的出現(xiàn)不過(guò)三十多年的時(shí)間,,但這種分離分析技術(shù)的發(fā)展十分迅猛,應(yīng)用十分***,。其儀器結(jié)構(gòu)和流程多種多樣,。典型的高效液相色譜儀結(jié)構(gòu)和流程可用下列方框圖表示(See Fig.3-4)。高效液相色譜儀一般都具備貯液器,、高壓泵,、梯度洗提裝置(用雙泵)、進(jìn)樣器,、色譜柱,、檢測(cè)器、恒溫器,、記錄儀等主要部件,。
高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點(diǎn),、熱穩(wěn)定性差,、有生理活性及相對(duì)分子量比較大的物質(zhì),因而廣泛應(yīng)用于核酸,、肽類(lèi),、內(nèi)酯、稠環(huán)芳烴,、高聚物,、藥物、人體代謝產(chǎn)物,、表面活性劑,,抗氧化劑、殺蟲(chóng)劑,、除銹劑的分析等物質(zhì)的分析,。
線(xiàn)性達(dá) 3000 mAU,,噪音級(jí)別降至 ±3 μAU,比較低分散和基線(xiàn)噪音,。
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“該儀器在同時(shí)運(yùn)行兩種相同化學(xué)分離或者同時(shí)運(yùn)行兩種不同化學(xué)分離時(shí),極大地提高了分析通量,,使我們能夠快速?gòu)耐粯悠分蝎@取大量表征數(shù)據(jù),。”--Jonathan Bones 博士 國(guó)家生物加工研究和培訓(xùn)研究所(NIBRT)
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高效液相色譜相關(guān)術(shù)語(yǔ)
峰面積(peak area,,A)—峰與峰底所包圍的面積。
保留時(shí)間(retention time,,tR)——從進(jìn)樣開(kāi)始到某個(gè)組分在柱后出現(xiàn)濃度極大值的時(shí)間,。
理論塔板數(shù)(theoretical plate number,N)——用于定量表示色譜柱的分離效率(簡(jiǎn)稱(chēng)柱效),。
分離度(resolution,,R)——相鄰兩峰的保留時(shí)間之差與平均峰寬的比值。也叫分辨率,,表示相鄰兩峰的分離程度,。R≥1.5稱(chēng)為完全分離。
《中國(guó)藥典》規(guī)定R應(yīng)大于1.5,。
拖尾因子(tailing factor,,T)——T=,用以衡量色譜峰的對(duì)稱(chēng)性,。也稱(chēng)為對(duì)稱(chēng)因子(symmetry factor)或不對(duì)稱(chēng)因子(asymmetry factor),。
《中國(guó)藥典》規(guī)定T應(yīng)為0.95~1.05。
T1.05為拖尾峰,。
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