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溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

來源： 發(fā)布時間：2024-06-09

免疫沉淀純化所得抗原量低有多種原因,，
A. 純化所得抗原量低
1. 抗原結合水平低
IP 應用中出現(xiàn)低抗原結合水平的可能原因有很多，結合反應所使用的溶液是重要原因之一,。必須使用適合的緩沖液,，有特定的pH和鹽濃度，可能還需要添加互作所需的輔助因子,。IP 或Co-IP 中用于純化的抗體是影響得率的另一個重要因素,。如果抗體本身易失活或與抗原結合微弱，則可能很難找到足夠溫和的條件,，即能產生結合,，又能保證在孵育和洗滌過程中結合可以穩(wěn)定保持。
2. 抗原洗脫水平低
在某些情況下,，抗原與抗體或結合蛋白結合之間可能會發(fā)生極強的相互作用,，傳統(tǒng)的洗脫緩沖液無法將其破壞。如果需要使用溫和洗脫緩沖液收集功能性抗原,，則上述矛盾尤為突出,。

免疫沉淀技術IP的實驗設計。溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

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免疫沉淀技術RIP（RNA Immunoprecipitation,，RNA免疫沉淀）是一種用于研究細胞內RNA與蛋白質相互作用的技術,。RIP技術可以幫助我們了解轉錄后調控網絡的動態(tài)過程，并發(fā)現(xiàn)miRNA等非編碼RNA的調節(jié)靶點,。
RIP技術的原理是利用針對特定RNA結合蛋白的抗體,，將細胞內的RNA-蛋白質復合物沉淀下來。然后,，可以通過分離純化,，對這些復合物中的RNA進行檢測，如qPCR驗證或測序分析,。
表觀遺傳學和RNA生物學領域對不同RNA作用和功能的關注增加,。RNA-蛋白質相互作用能夠調控mRNA和非編碼RNA的功能。對RNA潛能的這一新認識帶動了新方法的發(fā)展,，使研究人員能夠定位 RNA-蛋白質相互作用,。
深圳Protein AG免疫沉淀磁珠的選擇免疫沉淀技術ChIP的應用有哪些？

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“免疫沉淀”一般是指采用固定在固相支持物上的結合蛋白,，進行小規(guī)模的蛋白質親和純化的實驗,。更確切地說,，IP是采用固定在微珠支持物(一般是瓊脂糖樹脂)上的特定抗體，從復雜的混合物中,，純化單一抗原的實驗,。固定化蛋白質復合物的組裝既可以分步進行，也可以一步完成,。

常見的加樣順序：抗體和樣本(如細胞裂解物)一起孵育,，然后加入親和微珠，用于捕獲抗體-抗原復合物,。也可以將抗體和微珠(通過抗體結合蛋白,，如蛋白A、G或A/G等,，直接或間接結合抗體)先進行孵育，然后再加入含有抗原的樣本,。當抗原,、抗體和固相支持物產生結合以后，充分洗滌微珠,，再采用適當?shù)南疵摼彌_液從支持物上洗脫抗原,。

免疫沉淀純化所得抗原純度低一般有多種原因：
1. 非特異性蛋白污染
如果洗脫所得抗原純度較低，則有幾種方法可以進行優(yōu)化,。在結合或洗滌緩沖液中加入去污劑或其他可以降低非特異性結合的組分,。使用普通微珠預純化樣本還可以降低非目標分子的共純化。此外,，還可以使用無關蛋白 (如BSA) 封閉微珠 ,。
2. 抗體污染
使用蛋白A、G或A/G的經典免疫沉淀實驗中會出現(xiàn)抗體與抗原共洗脫的情況,。如果共洗脫會影響下游分析,，則需要使用抗體通過共價連接固定至微珠的方法進行實驗，如Pierce 直接 IP 或交聯(lián) IP 的形式,。
免疫沉淀樣本的制備,。

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Co-IP（免疫共沉淀）技術主要用于研究蛋白質之間的相互作用，其實驗設計如下：
1. 樣品準備：Co-IP實驗通常有兩種,，一種是內源性蛋白相互作用驗證,，一種是非內源性蛋白相互作用驗證。內源性相互作用通過質粒共轉染的方式將兩種蛋白轉染至同一細胞內表達,；非內源性相互作用則是將含有靶蛋白的組織進行預處理及細胞裂解獲得細胞裂解液,。
2. 沉淀誘餌蛋白：利用磁珠偶聯(lián)抗體沉淀誘餌蛋白。在樣品中加入磁珠偶聯(lián)抗體,，抗體會與誘餌蛋白結合,，利用磁鐵將磁珠拉下，同時誘餌蛋白會一起被沉淀出來。
3. SDS-PAGE及WB檢測：得到沉淀后,，需要驗證沉淀中是否存在相互作用蛋白,。先利用SDS-PAGE將蛋白復合物分離，隨后利用WB檢測是否存在靶蛋白,。
4. 實驗對照設置：為了避免“假陽性”,，需要設置正確的對照，包括陰性對照和陽性對照（Input組）,。Input組為直接利用抗體對細胞裂解液進行WB檢測,，驗證細胞裂解液中存在蛋白。
5. 結果真實性：確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,，而并非外源非特異蛋白,。使用單克隆抗體有助于避免污染的發(fā)生。
免疫沉淀ChIP技術選瓊脂糖珠還是磁珠,？深圳Protein AG免疫沉淀磁珠的選擇

免疫沉淀RIP技術選瓊脂糖珠還是磁珠,？溫州Co IP免疫沉淀磁珠原理

RIP技術的優(yōu)勢在于：
1. 特異性：利用特異性抗體，可以精確地捕獲目標RNA結合蛋白及其相互作用的RNA,。
2. 應用場景多：適用于研究RNA結合蛋白,、miRNA、lncRNA等非編碼RNA與蛋白質的相互作用,。
3. 技術結合：RIP后的RNA可以用于多種下游分析,，如qPCR、測序等,，為研究RNA的功能和調控提供了重要信息,。
RIP技術的限制包括：
1. 抗體質量：需要高質量的特異性抗體，否則可能得到假陽性或假陰性結果,。
2. 非特異性結合：可能存在非特異性結合問題,，需要仔細的實驗設計和對照來控制。
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