原代細胞培養(yǎng)實驗室常規(guī)步驟為：1）將動物組織從機體中取出并消毒除去存留在組織上的細菌、細菌,、等污染源,，這些污染源將會所需培養(yǎng)的原代細胞凋亡,、停止生長和繁殖直至死亡,，因此整個原代細胞培養(yǎng)過程中較全在無菌狀態(tài)下進行。2）將組織塊在選定的蛋白酶溶液中浸泡20-30分鐘,，通常在37C水浴里進行,，而蛋白酶的選定取決于部位組織和所需細胞的類型，比如成骨,、肌肉,、心、肝等就需要用胰蛋白酶才能解而出單個細胞,，但是對于腦組織和乳腺等軟組織,，就只能用分解能力較弱的膠原蛋白酶，以免損傷分散出來的單個細胞。3）將分散而成的單個細胞置于合適的培養(yǎng)基（含有特殊細胞生長因子,、添加劑以及血清,，或者無血清培養(yǎng)基）中培養(yǎng),，使細胞得以生存、生長和繁殖,，整個過程都是在無菌情況下操作。培養(yǎng)時間無論是酶消化法還是組織塊法,。珠海原代細胞分離試劑盒供應(yīng)商

取材的基本要求和注意事項敘述如下：一,、取材的基本要求（1）取材要注意新鮮和保鮮新鮮組織易于培養(yǎng)成功，取材時應(yīng)盡量在4~6h內(nèi)能制作成細胞,，盡快入箱培養(yǎng),，若不能即時培養(yǎng)，應(yīng)將組織浸泡于培養(yǎng)液內(nèi),，于4℃存放,。若組織塊較大,，應(yīng)在除去表面血塊、壞死組織,、脂肪和結(jié)締組織后，切碎于培養(yǎng)液內(nèi)4℃存放,，但時間不能超過24h。對于已切碎的組織或血液,、淋巴組織應(yīng)加入含10%二甲基亞砜的培養(yǎng)基,，按細胞凍存方式于液氮中冷凍保存。（2）取材應(yīng)嚴格無菌所取標本材料應(yīng)在無菌條件下進行,，為了確保無菌,，對所取材料若疑有污染的可能,，應(yīng)將所取組織在含高濃,。珠海原代細胞分離試劑盒供應(yīng)商將凍存管快速的放入37℃水浴中,，輕輕握住并旋轉(zhuǎn),，直到管內(nèi)物體完全融化,。

膠原酶的配制：建議看相關(guān)的文獻進行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進行配制,，配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱（注意現(xiàn)用現(xiàn)配）。胰酶（酶聯(lián)合法獲取原代細胞中會加入胰酶,，相關(guān)文章也蠻多的）膠原酶消化時間：根據(jù)組織特性，消化時間會有差異,。以小鼠腎細胞為例，加入膠原酶Ⅰ進行消化后,，放入37℃培養(yǎng)箱中消化45min~1h左右,，期間每10min中震蕩一次,，知道組織塊幾乎完全消失為止（若是組織塊剪得非常細小,，時間可以短一些，30min左右即可）,。原代細胞的獲?。好赶ǎ核迷噭耗z原酶和胰酶。

原代細胞轉(zhuǎn)染實驗要點：轉(zhuǎn)染過程不可添加物品,，否則會導致細胞死亡,；開始實驗siRNA的用量設(shè)置在終濃度10nM,、30nM,、50nM,、100nM進行摸索,，后續(xù)實驗根據(jù)實驗結(jié)果修改,。RFectPM可用來轉(zhuǎn)染siRNA,、antisenseRNA、microRNA等200bp以內(nèi)的小分子RNA和DNA,，可轉(zhuǎn)染絕大多數(shù)原代細胞,。對于大多數(shù)原代細胞，RFectPM的細胞轉(zhuǎn)染陽性率都在80%以上,，而轉(zhuǎn)染細胞死亡率不到10%。RFectPM的使用也極其簡便,，先將sRNA與RFectPM室溫混合，再將siRNA-RFectPM混合物直接加入含培養(yǎng)基的細胞,，血清對轉(zhuǎn)染效果沒有影響，不必刻意添加或更換培養(yǎng)液,。給懸浮培養(yǎng)的細胞換液時要注意不要吸出細胞。

原代細胞的小知識：凍存通常我們不推薦重新凍存原代細胞,，因為這可以促進細胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓?。原代細胞非常敏感，重新凍結(jié)可能導致細胞死亡或損傷,。與細胞系不同,，原代細胞增殖有限,，我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移,，如果你正在使用一個增殖困難的細胞類型,，你應(yīng)該密切監(jiān)測細胞形態(tài),，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著時間的推移,，大量生長從而成為主要細胞,。正常的原代細胞培養(yǎng),，在無污染的情況下,，建議培養(yǎng)基中不加抗體,，抗體會影響細胞的某些基因變異從而導致實驗數(shù)據(jù)有差異,，所以cellsystems的細胞在分離提取時就考慮到這點,，他們不會采用任何抗體去分離和純化的同時,，通過酶消化或者離心洗滌的方法讓細胞達到95%以上的純度，這樣得到的實驗數(shù)據(jù)更為準確,。原代內(nèi)皮細胞和血管平滑肌細胞都需要添加L-谷氨酰胺和成纖維細胞生長因子,。珠海原代細胞分離試劑盒供應(yīng)商

用專門的原代細胞培養(yǎng)基進行培養(yǎng),，較大限度提高原代細胞的生長。珠海原代細胞分離試劑盒供應(yīng)商

細胞凍存：通常我們不推薦重新凍存原代細胞,，因為這可以促進細胞衰老和/或?qū)е鹿δ茏兓Ｔ毎浅Ｃ舾?，重新凍結(jié)可能導致細胞死亡或損傷,。與細胞系不同，原代細胞增殖有限,，我們建議盡早使用原代細胞進行實驗以防止遺傳漂移,，如果你正在使用一個增殖困難的細胞類型,，你應(yīng)該密切監(jiān)測細胞形態(tài)，因為少量混雜的細胞（如成纖維細胞）可能隨著時間的推移,，大量生長從而成為主要細胞,。正常的原代細胞培養(yǎng)，在無污染的情況下,，建議培養(yǎng)基中不加抗體,，抗體會影響細胞的某些基因變異從而導致實驗數(shù)據(jù)有差異,，所以cellsystems的細胞在分離提取時就考慮到這點，他們不會采用任何抗體去分離和純化的同時,，通過酶消化或者離心洗滌的方法讓細胞達到95%以上的純度,，這樣得到的實驗數(shù)據(jù)更為準確,。珠海原代細胞分離試劑盒供應(yīng)商