qPCR技術(shù)的本質(zhì)是PCR技術(shù)，在擴(kuò)增的每個(gè)循環(huán)中模板DNA通過(guò)變性,、復(fù)性,、延伸三個(gè)階段形成更多數(shù)量的子代DNA，為下一個(gè)循環(huán)提供模板DNA。在每個(gè)循環(huán)結(jié)束后,，儀器會(huì)激發(fā)熒光物質(zhì)并檢測(cè)一次熒光信號(hào),，那么每一個(gè)循環(huán)都會(huì)對(duì)應(yīng)一個(gè)熒光信號(hào)值，將所有熒光信號(hào)值用光滑的曲線進(jìn)行連接起來(lái),，便是 qPCR擴(kuò)增曲線,。如圖所示，根據(jù)qPCR擴(kuò)增曲線整體趨勢(shì),，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程主要分為四個(gè)時(shí)期,，分別是基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期,、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期,。在基線期和平臺(tái)期，熒光信號(hào)均維持水平狀態(tài),，均不適用于對(duì)初始模板進(jìn)行定量分析。在線性增長(zhǎng)期,，雖然擴(kuò)增反應(yīng)仍在進(jìn)行,，但隨著反應(yīng)產(chǎn)物的積累，PCR反應(yīng)受到明顯抑制導(dǎo)致擴(kuò)增效率不斷降低,，此時(shí)產(chǎn)物不再以指數(shù)形式增長(zhǎng),，同樣不適用于定量分析初始模板量。根據(jù)qPCR擴(kuò)增曲線整體趨勢(shì),，整個(gè)擴(kuò)增過(guò)程主要分為四個(gè)時(shí)期,，基線期、指數(shù)增長(zhǎng)期,、線性增長(zhǎng)期和平臺(tái)期,。佛山qPCR儀設(shè)置

交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復(fù)合物并分離核組分:第一步對(duì)時(shí)間要求嚴(yán)格并且需要優(yōu)化。體內(nèi)共價(jià)交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質(zhì)-DNA相互作用并于特定時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行分析,。通常采用甲醛交聯(lián),，加入甘氨酸以終止反應(yīng)。交聯(lián)劑滲透到完整細(xì)胞中并將蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物鎖定在一起從而進(jìn)行分析,。交聯(lián)劑在整個(gè)過(guò)程中保持復(fù)合物穩(wěn)定,，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-DNA相互作用則不需要交聯(lián),。接下來(lái),，使用裂解液透化細(xì)胞膜，釋放細(xì)胞組分,，然后蛋白質(zhì)-DNA復(fù)合物變得可溶,。去除細(xì)胞溶質(zhì)蛋白以減少背景信號(hào)并增加靈敏度。注意：此時(shí)可以停止ChIP測(cè)定,。 經(jīng)過(guò)交聯(lián),，淬滅和洗滌細(xì)胞沉淀后,，將裂解物于-80℃儲(chǔ)存。Quantagene q225mxqPCR儀采購(gòu)qPCR通過(guò)內(nèi)參或者外參法對(duì)待測(cè)樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法,。

qPCR和dPCR:研究人員已經(jīng)通過(guò)兩種方式克服了定量PCR分析的挑戰(zhàn)：實(shí)時(shí)定量PCR(qPCR)和數(shù)字PCR(dPCR),。qPCR主要使用插入染料或熒光探針(例如TaqMan)。通過(guò)監(jiān)測(cè)PCR期間的熒光強(qiáng)度,，可以比較多個(gè)樣品的DNA水平,。數(shù)字PCR(dPCR)的基本工作原理很簡(jiǎn)單。先將樣品分為多個(gè)PCR反應(yīng),，每個(gè)反應(yīng)多包含一個(gè)模板,。然后通過(guò)對(duì)陽(yáng)性和陰性反應(yīng)進(jìn)行計(jì)數(shù)來(lái)確定初始樣品中模板分子的數(shù)量。盡管qPCR和dPCR都能夠定量樣品中的核酸,，但它們有一個(gè)重要的區(qū)別,。qPCR只能實(shí)現(xiàn)相對(duì)定量(例如，樣品A的目標(biāo)序列是樣品B的目標(biāo)序列的兩倍),，除非使用此標(biāo)準(zhǔn)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線,。數(shù)字PCR本身是定量的，不需要標(biāo)準(zhǔn)曲線,。另一方面,，qPCR技術(shù)更加成熟和眾所周知，市場(chǎng)上有大量商業(yè)產(chǎn)品可供選擇,。dPCR仍然是小的新鮮肉,。它不如qPCR使用且價(jià)格昂貴。與dPCR相比,，qPCR更適合于高通量分析,，并且動(dòng)態(tài)范圍廣。

染色質(zhì)片段化——DN段化:細(xì)胞核材料片段化是獲得良好的ChIP 分辨率的關(guān)鍵因素,，理想情況下的片段大小在 200 到 800 bp對(duì)之間,。剪切是難控制的步驟之一,。通過(guò)超聲處理和/或核酸酶/酶促消化可以實(shí)現(xiàn)剪切，各有利弊,。超聲處理需要大量的手動(dòng)操作時(shí)間,，但非常適合難以裂解的細(xì)胞；酶促消化不需要手動(dòng)操作,，適用于大量樣品的處理,，但其剪切位點(diǎn)不是隨機(jī)的。兩種方法都需要根據(jù)具體細(xì)胞系進(jìn)行優(yōu)化,。注意：此時(shí)可以停止ChIP,。經(jīng)過(guò)剪切/消化染色質(zhì)后，可以將樣品于-80°C儲(chǔ)存,。避免反復(fù)凍融,。在進(jìn)行大量SNP標(biāo)記分型時(shí)無(wú)需合成熒光探針和熒光引物?？梢缘墓?jié)省實(shí)驗(yàn)成本,。

傳統(tǒng)定量PCR方法簡(jiǎn)介：1）內(nèi)參照法：在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成,。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí),，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同,，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度,，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板,。2）競(jìng)爭(zhēng)法：選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中,，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）,。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段,，而待測(cè)模板不被酶切,，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù),。3）PCR－ELISA法：利用地高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合,，再加入抗地高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物,，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo),，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。熒光檢測(cè)系統(tǒng)可接收熒光信號(hào),，每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個(gè)熒光分子形成，熒光信號(hào)累積和PCR產(chǎn)物形成是同步,。華南地區(qū)快速qPCR儀設(shè)置

TaqMan方法通過(guò)采用熒光探針在PCR循環(huán)過(guò)程中隨著特定PCR產(chǎn)物的累計(jì)而對(duì)其進(jìn)行檢測(cè),。佛山qPCR儀設(shè)置

在擴(kuò)增曲線上，指定某個(gè)熒光強(qiáng)度值時(shí)可對(duì)應(yīng)得到達(dá)到這個(gè)值所需的循環(huán)數(shù),。選擇合適的熒光強(qiáng)度值,，該值的水平線可以切割到所有處于指數(shù)增長(zhǎng)期的擴(kuò)增曲線，這樣的熒光強(qiáng)度值稱為熒光閾值（threshold）,。在熒光進(jìn)入指數(shù)期初階段的熒光強(qiáng)度值符合這一特點(diǎn),。一般PCR擴(kuò)增的初始循環(huán)（默認(rèn)3~15個(gè)循環(huán)），熒光信號(hào)變化不大,，接近直線,，稱為基線（baseline），所以通常儀器默認(rèn)的閾值是PCR反應(yīng)~15個(gè)循環(huán)（熒光本底信號(hào)）的熒光信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍,。當(dāng)然,，實(shí)際還需要結(jié)合PCR擴(kuò)增效率、線性回歸系數(shù)等綜合考慮,。也可以將閾值手動(dòng)設(shè)置為大于熒光背景值和陰性對(duì)照（NTC）的熒光比較高值之間（進(jìn)入指數(shù)期的初階段）,。佛山qPCR儀設(shè)置

廣州雙螺旋科學(xué)儀器有限公司致力于精細(xì)化學(xué)品，是一家服務(wù)型公司,。公司業(yè)務(wù)涵蓋數(shù)字PCR,，純水機(jī)，病理切片機(jī),，倍性分析儀等,，價(jià)格合理，品質(zhì)有保證,。公司注重以質(zhì)量為中心,，以服務(wù)為理念，秉持誠(chéng)信為本的理念,，打造精細(xì)化學(xué)品良好品牌,。在社會(huì)各界的鼎力支持下，持續(xù)創(chuàng)新,，不斷鑄造高質(zhì)量服務(wù)體驗(yàn),，為客戶成功提供堅(jiān)實(shí)有力的支持,。