PCR（PolymeraseChainReaction）技術(shù),，即聚合酶連反應(yīng)，是一種擴(kuò)大和復(fù)制目的片段DNA的技術(shù),，其發(fā)現(xiàn)對(duì)于生命科學(xué)的發(fā)展具有重要的意義,。而3D數(shù)字PCR到底是什么鬼？它其實(shí)是出現(xiàn)的一款PCR儀,，其具有對(duì)目的DNA分子做出定量的優(yōu)點(diǎn),，進(jìn)而提供的準(zhǔn)確性、靈敏度,。應(yīng)用該技術(shù),，實(shí)現(xiàn)對(duì)DNA進(jìn)行精確定量，精確度可通過(guò)復(fù)制次數(shù)實(shí)現(xiàn),。通過(guò)準(zhǔn)確性的進(jìn)行定量檢測(cè)基因,，有助于臨床上在,、病毒等疾病作參考。同時(shí),，其具有高通量,，檢測(cè)速度快，成本相對(duì)低等優(yōu)點(diǎn),，為后期精細(xì)奠定基礎(chǔ),。dPCR的結(jié)果統(tǒng)計(jì)方式有2種，一種是采用標(biāo)記多種顏色,，另一種采用概率統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)處理方法,。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR定量檢測(cè)都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測(cè)定在各種條件上不會(huì)完全一致,，會(huì)造成PCR擴(kuò)增效率的差異,，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)影響,，可以進(jìn)行定量,。如何在雙通道設(shè)置及雙探針標(biāo)記的情況下實(shí)現(xiàn)多重檢測(cè)?不同位點(diǎn)的雙探針檢測(cè)體系中引物和探針采用不同的終濃度，這樣陽(yáng)性微滴的終點(diǎn)FAM/HEX熒光信號(hào)強(qiáng)度就會(huì)不同,，利用陽(yáng)性微滴不同的“分簇(cluster)”來(lái)區(qū)分不同的突變位點(diǎn),。采用對(duì)應(yīng)的KRAS野生型和突變型細(xì)胞系對(duì)雙重ddPCR檢測(cè)體系的性能進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示除了Q61H位點(diǎn)外,，其他位點(diǎn)的檢測(cè)體系在54C的情況下均能很好的區(qū)分4個(gè)明顯的cluster,。珠三角銳訊數(shù)字PCR系統(tǒng)通過(guò)“儀器+試劑”相互配合的方式，打出了數(shù)字PCR檢測(cè)的“組合拳”,。

數(shù)字PCR系統(tǒng)的分散方式?jīng)Q定了分散數(shù)量,，其結(jié)果基于統(tǒng)計(jì)的方法進(jìn)行定量，增加反應(yīng)單元數(shù)量（統(tǒng)計(jì)樣本量）,，可以增加其檢測(cè)的容量和動(dòng)態(tài)檢測(cè)線性范圍達(dá)到和qPCR相近的動(dòng)態(tài)范圍,，同時(shí)減小一個(gè)反應(yīng)單元中包含多個(gè)分子所造成的誤差，達(dá)到提高靈敏度和準(zhǔn)確度,。影響dPCR定量結(jié)果的因素包括：儀器采用的分散方式與數(shù)量,、溶液稀釋方法、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式,。分散方式與數(shù)量由數(shù)字PCR系統(tǒng)決定,，分散體積和結(jié)果表達(dá)方式需要實(shí)驗(yàn)人員在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中優(yōu)化得到。

在使用dPCR進(jìn)行轉(zhuǎn)基因檢測(cè)時(shí),，通常直接參照qPCR的方法,。使用不同技術(shù)對(duì)相同樣品檢測(cè)時(shí)，兩種方法的靈敏度是否具有可比性成為關(guān)注的問(wèn)題。Burns等21]使用Fluidigm公司的12.765（12板,，每板765個(gè)微單元）芯片數(shù)字PCR分析儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)ERM-AD413檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON810,。該小組應(yīng)用dPCR技術(shù)評(píng)估在qPCR定義下的靈敏度數(shù)值，在拷貝數(shù)200-700之間,，dPCR與qPCR的測(cè)量結(jié)果具有一致性,。但與qPCR的靈敏度相比，dPCR在低于拷貝數(shù)200時(shí)有被低估的風(fēng)險(xiǎn),，在高于拷貝數(shù)1000時(shí)有被高估的風(fēng)險(xiǎn),。dPCR在同一陣列上同時(shí)測(cè)量轉(zhuǎn)基因和內(nèi)源性靶點(diǎn)時(shí)，需要稀釋內(nèi)源性靶點(diǎn)和轉(zhuǎn)基因靶點(diǎn)在合理拷貝數(shù)范圍內(nèi)以保證dPCR測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性,。數(shù)字PCR具有諸多優(yōu)點(diǎn),，但也存在一定的不足，如成本高,、儀器操作復(fù)雜,、經(jīng)濟(jì)效益低等。

數(shù)字PCR系統(tǒng)通過(guò)其獨(dú)特的微流體陣列式芯片板（MAP）技術(shù),，提供強(qiáng)大而易于使用的數(shù)字PCR體驗(yàn),。這種專有技術(shù)可實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品進(jìn)行一致的自動(dòng)腔室化，可將一份樣品腔室化至20,000個(gè)微反應(yīng)室,，其變異系數(shù)（CV）達(dá)到比較好的<1%,。與其它數(shù)字PCR系統(tǒng)不同，MAP技術(shù)不使用乳液或其它基于液滴的方法對(duì)反應(yīng)進(jìn)行腔室化,。而是利用分配通道將試劑遞送至微反應(yīng)室,，具有高精密度和一致性。此外,，QuantStudioAbsoluteQ系統(tǒng)可分析加載樣品的95%以上,，確保獲得高度準(zhǔn)確的數(shù)字PCR結(jié)果。數(shù)字PCR通常采用大量分區(qū),。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

影響dPCR定量結(jié)果的因素：儀器采用的分散方式與數(shù)量,、溶液稀釋方法,、分散體積的準(zhǔn)確性以及結(jié)果表達(dá)方式,。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

現(xiàn)有dPCR分析方法采用熒光探針和基于光的檢測(cè)方法來(lái)鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物。這些方法要求足夠的靶分子擴(kuò)增以產(chǎn)生足以被檢測(cè)到的信號(hào),，但可能會(huì)導(dǎo)致額外的錯(cuò)誤或偏差,，因此，希望能夠提供一種改進(jìn)的,、用于檢測(cè)樣品內(nèi)感興趣的核酸的方法,，其采用替代性分析方法，具有提高的準(zhǔn)確度和精確度，并且其具有可以與基于dPCR的方法關(guān)聯(lián)使用的靈敏度,。dPCR還在樣品內(nèi)進(jìn)行單一反應(yīng),，但是所述樣品被分離成大量的分區(qū)(partition)，并且所述反應(yīng)在每個(gè)分區(qū)中單獨(dú)進(jìn)行,。這種分離允許對(duì)核酸量進(jìn)行靈敏的測(cè)量,。DPCR已被證明可有效用于研究基因序列中的變異，例如拷貝數(shù)變異或點(diǎn)突變,。上海微滴式數(shù)字PCR儀器

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