收集細胞后用培養(yǎng)基調整密度到1e5/ml,，在96孔板的各孔內加入100μl,。收集nk細胞,，用培養(yǎng)基調整密度到1e5/ml或是5e5/ml,，在相應的孔內加入100μl,。利妥昔單抗ritu***mab用培養(yǎng)基濃度調整到2mg/ml，在相應的孔內加入5μl,。曲妥珠單抗trastuzumab用培養(yǎng)基濃度調整到2mg/ml,，在相應的孔內加入5μl。按試劑盒說明書準備細胞自發(fā)釋放孔(*含raji,、bt-474,、mcf7或nk一種細胞)、靶細胞**大釋放孔(*含raji,、bt-474或mcf7細胞一種細胞),、體積校正孔(不含任何細胞)。準備對靶細胞殺傷試驗孔(raji+nk,、bt-474+nk,、或是mcf7+nk)、adcc殺傷試驗孔(raji+nk+ritu***mab,，bt-474+nk+trastuzumab,，mcf7+nk+trastuzumab)。其中,，對raji細胞的殺傷試驗加入1e5/ml的nk細胞100μl,，即e/t＝1:1,。而對bt-474和mcf7的殺傷試驗加入5e5/ml的nk細胞100μl，即e/t＝5:1,。在37℃,、5％co2培養(yǎng)3小時。向靶細胞**大釋放孔,、體積校正孔中加入20μl裂解液(lysissolution),。繼續(xù)培養(yǎng)45分鐘。從每孔轉移50μl上清至另一新的96孔板中,，按檢測試劑盒方法配制底物溶液,，每孔加入50μl底物溶液(substratesolution)，避光室溫孵育30min后每孔加入50ul反應停止溶液(stopsolution),。在讀板機(moleculardevices,。DMEM高糖培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)的標準選擇。福建細胞培養(yǎng)基供應商家

    包括以下步驟：在培養(yǎng)體系中添加改造抗體,；所述改造抗體為將互補決定區(qū)以外的區(qū)域經過蛋白質改造的細胞培養(yǎng)用抗體,，所述改造抗體與fc受體的親和力低于未經過蛋白質改造的細胞培養(yǎng)用抗體與fc受體的親和力。本發(fā)明還披露了一種改造抗體,，所述改造抗體為將互補決定區(qū)以外的區(qū)域經過蛋白質改造的細胞培養(yǎng)用抗體,，所述改造抗體與fc受體的親和力低于未經過蛋白質改造的細胞培養(yǎng)用抗體與fc受體的親和力。本發(fā)明還披露了一種細胞培養(yǎng)基,，包含基礎培養(yǎng)基和所述改造抗體,。本發(fā)明還披露了一種細胞產品，所述細胞產品為根據上述細胞培養(yǎng)方法得到的細胞產品,。本發(fā)明還披露了一種上述細胞產品在制備對腫*細胞具有殺傷作用的*物和試劑中的應用,。本發(fā)明還披露了一種用于*癥***的*物，包括上述細胞產品,。本發(fā)明還披露了一種用于異體細胞***的*物,，包括上述細胞產品?；谏鲜黾夹g方案,，本發(fā)明具有以下有益效果：該發(fā)明適用于已建立的細胞培養(yǎng)工藝，對細胞培養(yǎng)用抗體的原有機制沒有變動,，對培養(yǎng)工藝不需要做大的改動,。特別適合目前***使用的大規(guī)模細胞培養(yǎng)工藝中將細胞培養(yǎng)用抗體直接加入培養(yǎng)基的情況，操作簡便,。本發(fā)明可以提高細胞培養(yǎng)用抗體在細胞培養(yǎng)體系中的穩(wěn)定性,。山東無血清細胞培養(yǎng)基供應商家無酚紅培養(yǎng)基適用于對酚紅敏感的實驗。

    本發(fā)明涉及分子生物學及細胞生物學技術領域：，特別是涉及一種細胞培養(yǎng)方法,、改造抗體,、細胞培養(yǎng)基、細胞產品及其應用,。背景技術：：目前,，常用的細胞體外培養(yǎng)方法大量應用了細胞培養(yǎng)用抗體來結合目標細胞表面的特定受體分子，以達到***(activating)或是**(blocking)信號通路的目的,，促使目標細胞定向分化,、持續(xù)擴增或凋亡。在小規(guī)模培養(yǎng)時,，通常將這些抗體包被(coating)在培養(yǎng)皿表面,，或是交聯(lián)到磁珠上。在大規(guī)模培養(yǎng)時,，為了避免冗長的難以控制的包被過程,，或是為了節(jié)省高昂的磁珠成本、避免引入外源物質,，或是出于其他優(yōu)化工藝的目的,，經常會將這些抗體直接加入培養(yǎng)基中。但是,，這樣獲得的終產品普遍存在著純度較低,、活力較低的問題。目標細胞純度低,，意味著終產品中有過多的其他類型的細胞,。這些非目標細胞的功能與目標細胞的不同，其成分通常難以控制,，會極大增加科學試驗、特別是動物和人體體內試驗的復雜程度,，嚴重影響研究的重復性,。同樣，在臨床***應用上出于安全性和有效性考慮,，獲得盡可能高的純度和高的活力的細胞制品也是進行細胞***所必需的,。技術實現(xiàn)要素：基于此，有必要提供一種可提高細胞純度和活力的細胞培養(yǎng)方法,。本發(fā)明披露了一種細胞培養(yǎng)方法,。

    為解決上述技術問題，本發(fā)明提供的技術方案為：一種間充質干細胞培養(yǎng)基用于化妝品的制備方法,，包括以下步驟：(1)1號培養(yǎng)基的制備：取420ml的高糖mem倒入容器中,，向其中分別加入5ml100x青/鏈霉素混合液、5ml100x**酸鈉、5ml100x非必須氨基酸,、5ml100x谷氨酰鈉和50ml胎牛血清,，混勻后，過濾**,，備用,；(2)氯化鋰母液的制備：稱取100mg氯化鋰固體，溶于8ml高糖mem中,，充分溶解后定容至10ml,，此溶液濃度為10mg/ml；(3)2號培養(yǎng)基的制備：取416ml的高糖mem倒入容器中,，向其中分別加入5ml100x青/鏈霉素混合液,、5ml100x**酸鈉、5ml100x非必須氨基酸,、5ml100x谷氨酰鈉和50ml胎牛血清,，同時添加氯化鋰母液4ml，混勻后,，過濾**,，備用；(4)間充質干細胞(msc)的分離與培養(yǎng)：將臍帶**沿臍帶縱向切開,，剝離其中的血管,；用剪刀分離臍帶**內側的沃頓膠，將分離的沃頓膠切成1mm3的小塊,，然后將其接種于細胞培養(yǎng)皿中,，加入適量的1號培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿放置于溫度為37℃,、二氧化碳濃度為5％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-14天,，期間于第二天適當加液后，每隔三天換1號培養(yǎng)液一次,；細胞培養(yǎng)至80％融合度,，用％胰酶-edta溶液消化已經貼壁的間充質干細胞，并按照1：3的比例進行傳代培養(yǎng),。DMEM培養(yǎng)基適合于基因編輯和轉染實驗,。

    特別是l235的側鏈與fcγriii的疏水相互作用。在一些推薦實施方式中,，將l235突變?yōu)槠渌被?，特別是帶電荷的氨基酸(谷氨酸glu，天冬氨酸asp,，精氨酸arg,，賴氨酸lys)或是存在空間位阻的大基團側鏈氨基酸(苯丙氨酸phe等),可以減弱抗體與fc受體的結合,。在一些推薦實施方式中，將l234突變?yōu)槠渌被?，特別是影響主鏈構象的氨基酸(甘氨酸gly,，脯氨酸pro)，可以減弱抗體與fc受體的結合,。higg1的p329參與了與hfcγriii的結合,，特別是與fcγriii的疏水相互作用。在一些推薦實施方式中,，將p329突變?yōu)槠渌被?，特別是帶電荷的氨基酸或是不帶電荷的極性氨基酸(絲氨酸ser，蘇氨酸t(yī)hr等),，可以減弱抗體與fc受體的結合,。在一個更加推薦的實施方式中，對higg1進行l(wèi)234a,、l235r,、p329d和a330s突變。序列插入在一些實施方式中,，上述序列插入是將將來源于亞型igg1,、igg3抗體的cdr插入到igg2抗體或igg4抗體的骨架上。在一個推薦實施方式中,，將這些cdr插入到igg4抗體的骨架上,。在一個推薦實施方式中，將這些cdr插入到進行了其他所述改造了的,、與fc受體的親和力降低的抗體的骨架上,。在一個更加推薦的實施方式中，將這些cdr插入到進行了所述點突變改造的igg1抗體的骨架上,。減血清培養(yǎng)基減少了實驗中血清帶來的變異性,。江西細胞培養(yǎng)基代理商

使用DMEM高糖培養(yǎng)基可以減少實驗誤差。福建細胞培養(yǎng)基供應商家

    改造實例3抗人cd3細胞培養(yǎng)抗體的改造本實施例將抗人cd3的小鼠igg2a單抗okt3的cdr序列插入到改造實例2的igg1骨架上,，然后進行表達和純化,，得到改造抗體acd3-sh。將okt3輕鏈和重鏈的蛋白質序列與higg1-kappa(κ)輕鏈和higg1重鏈的分別進行序列比對(圖6a,，b)，確認6個cdr序列,?；瘜W合成經過密碼子優(yōu)化后的cdr表達dna序列，通過重疊pcr等基因工程方法進行拼接,，獲得用于表達輕鏈的質粒pm-okt3h-lc(圖6c)和包含改造實例2中4個點突變的用于表達重鏈的質粒pma-okt3h-hc(圖6d),。在293f細胞中表達，經過proteina親和層析、離子交換層析,、脫鹽柱層析,，獲得高純度的抗體產品，命名為acd3-(okt3h-fab)-(fca),，簡稱acd3-sh,，其重鏈序列和輕鏈序列分別見。對產品進行電泳檢查,，結果如圖7所示,，其中m為分子量標準(mwladder)，lane1和2為目標抗體,。二,、細胞培養(yǎng)和抗體活力檢測培養(yǎng)實例1t細胞培養(yǎng)及抗人cd3抗體的擴增活力檢測本測試分別用改造實例3中獲得的改造抗體acd3-sh和其原型抗體okt3來刺激人pbmc中t細胞(cd3+)的增殖，用mts(cas#138169-43-4)對細胞進行染色,，來定量確定抗體的活力,，即半數(shù)有效劑量(ed50)。材料人靜脈血,，人外周血淋巴細胞分離液(天津灝洋,，lts1077)，il-2(北京雙鷺,。福建細胞培養(yǎng)基供應商家