空心圓圈),，原型抗體okt3的ed50為130ng/ml(圖8，實心圓),，說明目標細胞t細胞對acd3-sh更加敏感,。同時,，在飽和抗體濃度下,，acd3-sh的**大擴增信號也明顯強于okt3的。結(jié)果顯示,，改造抗體acd3-sh明顯具有更高的激發(fā)t細胞擴增的活力,。培養(yǎng)實例2nkt細胞培養(yǎng)及抗人cd3抗體的擴增活力檢測本測試分別用改造實例3中獲得的改造抗體acd3-sh和其原型抗體okt3來刺激人pbmc中nkt細胞(cd3+cd56+)的增殖，通過對細胞計數(shù)來比較活力,。材料人靜脈血,，基礎(chǔ)培養(yǎng)基gt-t551(takara，wk551t),，擴增培養(yǎng)基(gt-t551,，il-21000iu/ml)，細胞培養(yǎng)瓶t75(corning,，430720)/t175(corning,，431080)，ifn-γ(上海凱茂,，注射用重組人干擾素γ伽瑪),。細胞培養(yǎng)和檢測方法利用白細胞分離液分離人pbmc細胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至2e6/ml,，置于培養(yǎng)瓶內(nèi),。在37℃、5％co2培養(yǎng)2小時,，以使單核細胞貼壁,。收集懸浮細胞，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1e6/ml,。加入重組人ifn-γ(1000iu/ml),。在37℃,、5％co2培養(yǎng)24小時。加入抗人cd3抗體(30ng/ml)和il-2(1000iu/ml),，繼續(xù)培養(yǎng)48小時,。按照1:1體積比例添加擴增培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48小時,。之后每隔48小時取樣計數(shù),，用擴增培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至，繼續(xù)培養(yǎng),。DMEM高糖培養(yǎng)基是細胞培養(yǎng)的理想選擇。遼寧基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基

    lnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaproglualaarggly0glyproservalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisglnasptrpleuasngly0lysglutyrlyscyslysvalserasnlysalaleuaspserproileglulysthrileserlysalalysglyglnproarggluproglnvaltyrthrleuproproserarggluglumetthrlysasnglnvalserleuthrcysleuvallysglyphetyrproseraspilealavalglutrpgluserasnglyglnprogluasnasntyrlysthrthrpropro0valleuaspseraspglyserphepheleutyrserlysleuthrvalasplysserargtrpglnglnglyasnvalphesercysservalmethisglualaleuhisasnhistyrthrglnlysserleuserleuserproglylys4503449prt人工序列,。上海細胞培養(yǎng)基生產(chǎn)企業(yè)1640培養(yǎng)基能夠支持多種細胞系的穩(wěn)定生長,。

    平衡鹽溶液（balancedsaltsolution，BSS）簡稱鹽溶液,，集緩沖液的緩沖能力,、生理鹽水的等滲性以及培養(yǎng)液的營養(yǎng)供應(yīng)特點于一體，兼具維持滲透壓,、緩沖和調(diào)節(jié)溶液的酸堿度,、同時供給細胞生存所必需的能量和無機離子成分的作用。各種BSS的緩沖系統(tǒng)有所不同,，其中以Hank’s液和Earle’s液為例,，它們主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Earle’s()中比在Hank’s()中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,，以維持溶液的pH值。Eagles液在空氣水平的CO2中,，溶液會變堿，Hank’s液在CO2培養(yǎng)箱中會變酸,。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存**，需要用Earle’s液,，,。如果**是清洗將要在細胞培養(yǎng)基中儲存的**,，用Hank’s液就可以了,。一些BSS含有的Ca2+、Mg2+是細胞膜的重要組成成分,，同時參與許多重要的細胞功能活動,。但它們有使細胞凝集的作用，在配制分散細胞的消化液和特殊用途的細胞洗滌時,，宜采用Ca2+,、Mg2+含量較低的Dulbecco液或無Ca2+、Mg2+的D-Hanks液,，或者PBS液,。基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基主要包括199,、MEM,、RPMI-1640、DMEM,、DMEM/F12等,。主要成分是氨基酸、維生素,、碳水化合物,、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。人工合成培養(yǎng)基使用時還需添加一定量的血清使細胞生長和繁殖氨基酸：組成蛋白質(zhì)的基本單位,。

    其重鏈序列見seqid**,。改造實例2抗人cd52細胞培養(yǎng)抗體的改造本實施例將表達抗人cd52的人源化的igg1型campath-1h單抗的序列進行突變,，然后進行表達和純化,，得到改造抗體acd52-sh。如圖4所示,，以表達campath-1h單抗重鏈的序列(圖4a)為模板,，利用引物對primer2-3f/primer2-arr、primer2-arf/primer2-dsr,、primer2-dsf/primer2-3r分別進行pcr獲得3個片段后，再通過重疊pcr進行拼接,。引物對序列如下表所示,。如圖4b，純化獲得的pcr產(chǎn)物在經(jīng)過限制性內(nèi)切酶ecori(gaattc)和naei(gccggc)處理后,，插入表達質(zhì)粒中,，獲得表達重鏈的質(zhì)粒(pma-c1h-hc)。序列中完成了l234a,、l235r,、p329d和a330s突變。測序確認pma-c1h-hc序列是正確的,。將用于表達campath-1h輕鏈的質(zhì)粒pm-c1h-lc與上述用于表達改造后campath-1h重鏈的質(zhì)粒pma-c1h-hc進行等摩爾數(shù)混合,，用pei共轉(zhuǎn)染處于對數(shù)生長期的293f細胞,。在37℃、5％co2培養(yǎng)5天后,，離心收集培養(yǎng)基,。經(jīng)過proteina親和層析、離子交換層析,、脫鹽柱層析,，獲得高純度的抗體產(chǎn)品，命名為acd52-(c1h-fab)-(fca),，簡稱acd52-sh,，其重鏈序列見。對產(chǎn)品進行電泳檢查,，結(jié)果如圖5所示,，其中m為分子量標準(mwladder)，lane1和2為目標抗體,。使用DMEM高糖培養(yǎng)基能簡化實驗流程,。

    例如將igg1亞型的抗人cd3的小鼠單抗ucht1、抗人cd16的小鼠單抗3g8和mem-154,、抗人cd28的小鼠單抗cd-28,、抗人cd137的小鼠單抗4c1a9等抗體的鉸鏈區(qū)和fc段替換為鼠igg4相應(yīng)的序列。在一個更加推薦的實施方式中,，將這些序列替換為人igg4相應(yīng)的序列,。推薦地，在進行鉸鏈區(qū)和fc段的替換時,，選擇igg1-ch1-hinge區(qū)域中盡可能靠近c端的一段與igg4-ch1-hinge中的相同的序列開始替換,，以盡可能保持ch1和vh1的相互作用，維護fab段的功能,。點突變在一些實施方式中,，上述點突變是將細胞培養(yǎng)用抗體的鉸鏈區(qū)和fc段關(guān)鍵結(jié)合部位的一個或多個位點的氨基酸進行突變。在一些實施方式中,，細胞培養(yǎng)用抗體為igg1亞型,，上述點突變是將細胞培養(yǎng)用抗體的第228位、第233位,、第234位,、第235位、第236位,、第239位,、第250位、第252位、第254位,、第256位,、第257位、第311位,、第318位,、第320位、第322位,、第326位,、第327位、第329位,、第330位,、第331位、第332位,、第333位,、第428位、第433位和第434位氨基酸中的一個或多個位點進行突變,。在一些實施方式中,，也可對上述位點的臨近氨基酸進行突變。這些位點中,，higg1的l234和l235的主鏈和側(cè)鏈基團都參與了與hfcγriii的結(jié)合,。F12培養(yǎng)基在細胞生物學研究中廣泛應(yīng)用，適用于多種細胞系,。寧夏1640RPMI細胞培養(yǎng)基供應(yīng)商

DMEM高糖培養(yǎng)基的配方適合大多數(shù)細胞類型,。遼寧基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基

    artificialsequence)3glnvalglnleuglnglnserglyalagluleualaargproglyala151015servallysmetsercyslysthrserglytyrthrphethrargtyr202530thrmethistrpvallysglnargproglyglnglyleuglutrpile354045glytyrileasnproserargglytyrthrasntyrasnglnlysphe505560lysasplysalathrleuthrthrasplysserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaargtyrtyraspasphistyrcysleuasptyrtrpglyglnglythrthrleuthrvalserseralaserthrlysglyproservalpheproleualaproserserlysserthrserglyglythralaalaleuglycysleuvallysasptyrpheprogluprovalthrvalsertrp0asnserglyalaleuthrserglyvalhisthrpheproalavalleuglnserserglyleutyrserleuserservalvalthrvalproserserserleuglythrglnthrtyrilecysasnvalasnhislysproserasnthrlysvalasplysargvalgluprolyssercysasplysthrhisthrcysproprocysproalaproglualaargglyglypro0servalpheleupheproprolysprolysaspthrleumetileserargthrprogluvalthrcysvalvalvalaspvalserhisgluaspprogluvallyspheasntrptyrvalaspglyvalgluvalhisasnalalysthrlysproargglugluglntyrasnserthrtyrargvalvalservalleuthrvalleuhisgl。遼寧基礎(chǔ)細胞培養(yǎng)基